CRISPR利器出鞘：敲除大麦蛋白酶抑制剂，提升谷物与大豆蛋白消化效率

蛋白质的高效消化对于维持人类健康饮食至关重要，同时对于减轻农业活动对气候和环境的影响也具有深远意义。在植物性食物来源中，特别是谷物籽粒，含有多种抗营养因子，这些因子会干扰人体或动物消化道内源或外源添加的酶类对营养物质的有效利用。其中，蛋白酶抑制剂（Protease inhibitors, PIs）是一类重要的抗营养因子，它们能够抑制蛋白酶的活性，从而阻碍蛋白质的分解吸收。这不仅影响饲料和食品的营养价值，导致氮素等营养物质流失增加，加剧环境污染，甚至可能与某些人类疾病（如乳糜泻）相关。尽管植物内源的蛋白酶抑制剂在种子萌发调控和抵抗病虫害方面有其生理功能，但在消化过程中它们的存在却是不利的。不同谷物品种及其批次之间，蛋白酶抑制剂的种类和含量差异显著，这导致了蛋白质消化效率的不稳定。因此，寻找有效途径降低或消除谷物中蛋白酶抑制剂的负面影响，对于提高植物蛋白利用率、保障粮食安全和促进可持续农业发展具有重要意义。

丹麦奥胡斯大学（Aarhus University）农业生态系的Henrik Brinch-Pedersen教授团队在国际知名期刊Plant Biotechnology Journal上发表了题为“Simplex and multiplex CRISPR/Cas9-mediated knockout of grain protease inhibitors in model and commercial barley improves hydrolysis of barley and soy storage proteins”的研究论文。该研究揭示了利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，通过单基因（simplex）和多基因（multiplex）敲除的方式，在模式大麦品种“Golden Promise”和商业大麦品种“Stairway”中特异性地沉默多种谷物蛋白酶抑制剂基因后，能够显著降低其对商业饲用蛋白酶及消化道常见蛋白酶（如胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶）的抑制活性，并显著提高了大麦自身储藏蛋白（B-、C-醇溶蛋白）以及重要植物蛋白来源——大豆的主要储藏蛋白（大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白）在体外的水解效率。

主要研究结果介绍

1. 不同大麦品种对蛋白酶的抑制能力存在差异

研究团队首先评估了模式大麦品种Golden Promise（GP）和多个现代商业大麦品种（如Stairway、Greenway等）的籽粒提取物对商业饲用蛋白酶Ronozyme ProAct的抑制能力。结果显示，不同品种间抑制能力差异显著。其中，GP品种表现出中等水平的抑制（约保留70%-90%酶活）；商业品种Greenway抑制作用最弱（保留91%酶活）；而商业品种Stairway则表现出最强的抑制作用，仅允许约65%的蛋白酶活性残留（图1）。这一结果表明，蛋白酶抑制剂的含量和组成在不同大麦品种间存在遗传差异，并直接影响外源蛋白酶的效率。这也为后续选择GP作为模式系统和Stairway作为具有改良潜力的商业品种进行基因编辑提供了依据。

图1

2. 利用CRISPR/Cas9技术创制蛋白酶抑制剂基因敲除突变体

基于基因组信息，研究人员选择了在成熟大麦籽粒中表达的六个主要丝氨酸蛋白酶抑制剂基因作为编辑目标，包括三种胰凝乳蛋白酶抑制剂（Chymotrypsin inhibitor, CI-1A, CI-1B, CI2）、一种丝氨酸蛋白酶抑制剂Z4（Serpin-Z4）、一种Bowman-Birk胰蛋白酶抑制剂（BBI）和一种大麦α-淀粉酶/枯草杆菌蛋白酶抑制剂（BASI）（表1）。利用CRISPR/Cas9系统，在GP品种中通过农杆菌介导的未成熟胚转化方法，成功获得了针对这六个基因的单基因敲除突变体，以及CI-1A/CI-1B双基因敲除和CI-1A/CI-1B/CI2三基因敲除的复合突变体。通过测序验证，确认了大部分突变体在靶标位点产生了移码突变，导致目标蛋白酶抑制剂功能丧失（图2, 图S1）。值得注意的是，由于CI-1A和CI-1B基因序列高度同源（93.1%），针对CI-1B设计的gRNA同时也在CI-1A基因上产生了突变，而针对CI-1A的gRNA则只特异性地编辑了CI-1A。这一现象使得研究者能够利用单个gRNA策略获得CI-1A单突变体和CI-1A/CI-1B双突变体（图S2）。

表1

图2

3. Golden Promise突变体中蛋白酶抑制活性的改变

研究人员检测了GP野生型（WT）和各突变体籽粒的水溶性蛋白提取物对三种不同蛋白酶——α-胰凝乳蛋白酶、Ronozyme ProAct和胰蛋白酶——的抑制效果。

• 对α-胰凝乳蛋白酶的抑制： WT提取物表现出强烈的抑制作用。所有单个基因敲除体（BBI除外）在较高提取物浓度下均显著降低了抑制作用。其中，ci2单突变体的效果最明显。而ci-1a/1b/2三基因敲除突变体的效果最为显著，在所有测试浓度下均表现出最低的抑制作用（即最高的残留酶活），残留酶活维持在81.8%至86.7%之间（图3a）。

• 对Ronozyme ProAct的抑制： WT提取物对该酶的抑制作用相对较弱。所有胰凝乳蛋白酶抑制剂的敲除（ci-1a, ci-1b/1a, ci2, ci-1a/1b/2）均显著降低了抑制作用，且效果随着敲除基因数量的增加而增强。ci-1a/1b/2三突变体的效果最佳，在较高提取物浓度下，其残留酶活甚至超过了100%（达到116%），这可能与提取物中去除了抑制剂同时含有少量内源蛋白酶有关。bbi和basi突变体在低浓度下也显示出一定的抑制降低效果，而serpin-z4突变体影响甚微（图3b）。

• 对胰蛋白酶的抑制： 正如预期，胰凝乳蛋白酶抑制剂的敲除对胰蛋白酶抑制的影响较小。BBI是已知的胰蛋白酶抑制剂，其敲除突变体（bbi）表现出最显著的抑制降低效果，在所有浓度下均显著优于WT。serpin-z4突变体在较高浓度下也显示出一定的抑制降低作用（图3c）。

图3

4. Golden Promise突变体改善大麦醇溶蛋白的体外降解

为了评估蛋白酶抑制剂敲除对底物蛋白实际消化的影响，研究人员选用了表现最佳的ci-1a/1b/2三突变体，比较了其籽粒提取物与WT提取物存在下，Ronozyme ProAct和α-胰凝乳蛋白酶对重组表达的大麦主要储藏蛋白——B-醇溶蛋白（rB-hordein）和C-醇溶蛋白（rC-hordein）——的体外降解能力。SDS-PAGE凝胶电泳分析显示，与WT提取物相比，三突变体提取物显著促进了两种重组醇溶蛋白的降解，表现为残留的蛋白条带强度显著减弱（图4a, 4b）。这直接证明了敲除这些蛋白酶抑制剂能够有效提升大麦自身储藏蛋白的体外消化效率。

图4

5. 商业大麦品种Stairway的基因编辑及效果评估

考虑到Stairway品种具有较高的内源蛋白酶抑制水平和潜在的改良价值，研究团队进一步在该品种中进行了基因编辑。他们采用了基于大麦卵细胞（ovule）的农杆菌介导转化方法，该方法不依赖于常规的未成熟胚培养，且无需使用筛选标记基因（selection-gene-free），成功获得了CI-1A基因的敲除突变体（图5a, 图S3）。

• 对Ronozyme ProAct的抑制： 与GP品种不同，Stairway中的ci-1a纯合突变体仅凭单个基因的敲除，就表现出对Ronozyme ProAct抑制活性的急剧下降，残留酶活从WT的约72%提升至96%（在100%提取物浓度下）（图5b）。其效果几乎与GP中的三基因敲除突变体相当，这揭示了CI-1A在Stairway品种中是主要的蛋白酶抑制因子，也凸显了不同品种间蛋白酶抑制剂组成和贡献度的差异。

• 对醇溶蛋白和大豆蛋白的降解： 进一步的体外降解实验表明，与WT相比，Stairway ci-1a突变体提取物显著增强了Ronozyme ProAct对rB-和rC-醇溶蛋白的降解（图5c）。同时，该突变体提取物也显著促进了Ronozyme ProAct对大豆主要储藏蛋白——大豆球蛋白（glycinin）的降解（图5d），以及α-胰凝乳蛋白酶对β-伴大豆球蛋白（β-conglycinin）α'亚基的降解（图5f）。这些结果证明，降低大麦自身的蛋白酶抑制剂水平，不仅能改善其自身蛋白的消化，还能提高对外源植物蛋白（如大豆蛋白）的消化效率。

图5

6. 农艺性状评估

为了评估基因编辑是否带来负面农艺影响，研究人员比较了GP三突变体、Stairway ci-1a突变体与相应WT植株的穗长、穗数和千粒重（TKW）。结果显示，在所评估的性状中，突变体与WT之间没有显著差异，且穗型保持不变（图S4）。这初步表明，针对这些蛋白酶抑制剂的基因编辑并未对大麦的主要农艺性状产生明显的不利影响。

全文总结与展望

本研究成功利用CRISPR/Cas9技术，在模式大麦品种Golden Promise和商业品种Stairway中实现了对多个关键蛋白酶抑制剂基因的单重或多重敲除。研究结果清晰地表明：

敲除特定的蛋白酶抑制剂基因（尤其是胰凝乳蛋白酶抑制剂CI-1A, CI-1B, CI2和胰蛋白酶抑制剂BBI）能够显著降低大麦籽粒提取物对相应外源蛋白酶的抑制活性。

在Golden Promise中，多基因敲除（特别是三联敲除）的效果优于单基因敲除，显示出抑制剂功能的叠加效应。

在商业品种Stairway中，仅敲除CI-1A基因就足以大幅降低其主要的蛋白酶抑制活性，表明CI-1A是该品种的关键抑制因子，并突显了品种特异性在改良策略中的重要性。

降低蛋白酶抑制剂水平显著促进了大麦自身储藏蛋白（醇溶蛋白）以及重要外源植物蛋白（大豆蛋白）在体外的酶解效率。

该研究首次证明了利用无筛选标记的卵细胞转化体系进行商业大麦基因编辑的可行性。

初步农艺性状评估未发现这些基因编辑对产量相关性状有负面影响。

综上所述，这项研究不仅揭示了大麦中不同蛋白酶抑制剂的功能及其对蛋白质消化的负面影响，更提供了一种通过基因编辑技术精准改良谷物营养价值的有效策略。该策略有望应用于培育新型大麦品种，提高其作为饲料和食品时的蛋白质消化利用率，减少营养流失和环境污染，并可能改善大麦的麦芽品质。此外，研究结果也提示，降低谷物内源蛋白酶抑制剂可能有助于提高混合日粮中其他植物蛋白（如大豆）的消化效率。未来的研究可进一步在动物模型中验证这些改良效果，深入探究其作用机制，并将其应用于更广泛的育种实践中。

研究团队与资助

本文的第一作者是奥胡斯大学农业生态系的Michael Panting。通讯作者是该系的Henrik Brinch-Pedersen*教授。该研究得到了丹麦创新基金（Innovation Fund Denmark, 项目号8055-00038B）、诺和诺德基金会（Novo Nordisk Foundation, NovoCrops项目, 项目号NNF19OC005658）以及欧盟地平线研究与创新计划（European Union's Horizon research and innovation program, BarleyMicroBreed项目, 授权协议号101060057）的资助。

文章链接

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/pbi.70065

小麦族多组学网站：http://wheatomics.sdau.edu.cn

投稿、合作等邮箱：shengweima@icloud.com

（转自：小麦研究联盟）