Nat Commun | 荣知立/林瑛团队利用环状gRNA提高小型CRISPR/ Cas12f系统的编辑效率

CRISPR/Cas系统作为重要的基因编辑工具，凭借多样化的功能，已成为基础研究、疾病建模、功能基因组筛选及基因治疗等领域的核心技术。其中，Cas9和Cas12a作为最常用的核酸酶，已在多种生物体中实现高效的基因编辑。然而，这些核酸酶编码序列长，导致在体内递送过程中，尤其是在病毒载体如腺相关病毒（AAV）中的包装能力受限，严重制约了其在临床治疗中的应用。

相较而言，源自古菌的Un1Cas12f，因其紧凑结构（仅529个氨基酸），展现出天然的递送优势。这一超小型化特性不仅突破了AAV载体的包装限制，也为构建多功能集成化基因治疗系统提供了可能。然而，Un1Cas12f在哺乳动物细胞中的编辑效率显著低于传统Cas核酸酶，这一关键性能缺陷制约了其临床应用潜力。因此，如何有效提升Cas12f的编辑活性，成为推动其临床转化和广泛应用的关键科学问题和技术瓶颈。

2025年3月28日，南方医科大学基础医学院荣知立教授和林瑛副教授团队在Nature Communications杂志在线发表了题为Engineered Circular Guide RNAs Enhance Miniature CRISPR/Cas12f-based Gene Activation and Adenine Base Editing的研究论文。该研究通过构建环状gRNA（circular gRNA，cgRNA），显著提升了Cas12f系统在基因激活及腺嘌呤碱基编辑（ABE）中的效率，为发展精准、高效、可递送的基因治疗工具提供了关键突破。

研究团队采用工程化策略构建了特异性适配Un1Cas12f的cgRNA：基于Tornado表达系统，在gRNA两端引入Twister核酶序列，利用其自剪切特性生成特定末端，并借助内源性RNA连接酶RtcB实现gRNA分子闭环，从而构建出更稳定、表达水平更高的cgRNA分子。为避免核酶对CRISPR系统产生潜在干扰，研究者设计了合适的连接序列，确保各组分功能协同而不冲突。实验结果表明，cgRNA在结构稳定性和细胞内表达水平方面均明显优于常规gRNA。

功能实验显示，cgRNA可使Cas12f介导的基因激活效率提升1.9-19.2倍。进一步结合液-液相分离策略，将FUS蛋白的无序结构域（FUSIDR）与Cas12f融合，可使基因激活效率再次提升2.3-3.9倍。在腺嘌呤碱基编辑系统（ABE）中，cgRNA不仅提高了A-to-G转换效率，还显著缩窄了编辑窗口，实现高效率高精度编辑。更重要的是，在小鼠体内实验中，cgRNA亦显著增强了Cas12f的基因激活能力，证明其具备良好的体内递送兼容性和转化潜力。

图1：Cas12f/ cgRNA系统的应用

本研究为开发适用于体内递送的小型CRISPR系统提供了有力支持，尤其在需高效、精准编辑的疾病治疗中展现出广阔应用前景。未来，若结合人工智能驱动的RNA结构预测技术，cgRNA的设计与性能有望进一步优化，推动基因编辑技术在临床中的应用。

南方医科大学荣知立教授和林瑛副教授为该论文通讯作者。广州医科大学张鑫教授和南方医科大学硕士研究生李梦绕为共同第一作者。

https://www.nature.com/articles/s41467-025-58367-4

制版人： 十一

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