Nat Biotechnol | 李大力等团队开发光激活RNA碱基编辑器用于体内基因治疗

在基因和细胞治疗领域，基因替代疗法已广泛应用于临床。然而，如何在疾病治疗过程中实现外源基因时空特异性地反复可逆的表达调控仍面临挑战。相较于DNA编辑技术造成基因序列的永久改变，RNA编辑则可通过动态可逆的方式调控蛋白质表达，这一独特优势使其成为极具潜力的基因治疗策略。目前，基于RNA水平的可调控基因表达系统主要包括以下几类：适配体依赖的核酸开关、小分子诱导的可变剪接系统以及RNA结合蛋白响应开关等【1】。这些系统通过调控mRNA的稳定性、剪接过程或翻译效率来实现基因表达的可控调节。然而，现有技术主要局限于外源基因的调控，在内源基因的精确控制方面仍存在局限性。

RNA碱基编辑系统能够在内源和外源RNA中执行精准的碱基转换从而实现特定基因功能的激活或者失活【2】。腺苷RNA碱基编辑器因其编辑效率高，在疾病治疗中极具潜力【3】。它以腺苷脱氨酶（ADAR）为核心催化酶，将双链RNA底物中的腺苷（A）转换为肌苷（I），由于肌苷与鸟苷（G）的结构相似，在蛋白质翻译过程中它能够与胞苷（C）配对，从而实现A>G的碱基转换效果。根据编辑器中ADAR的来源，RNA腺苷碱基编辑器可分为两大类：第一类通过招募内源ADAR到靶点附近实现A>I编辑，例如LEAPER系统【2】。第二类过表达与可靶向目标RNA模块融合的ADAR蛋白，实现位点特异性的A>I编辑，例如，REPAIR系统【3】。这些RNA碱基编辑器均能在细胞和动物体内实现高效编辑，但持续性表达的ADAR导致大量的脱靶编辑，造成安全隐患。为解决这一问题，研究者开发了多种可调控的RNA编辑器。这些技术均采用持续表达完整的ADAR蛋白的模式，在非诱导条件下具有很高本底活性，难以实现目标RNA的灵敏、可控的编辑【4,5】。而过表达ADAR蛋白会造成较严重的转录组脱靶效应以及潜在的致癌风险。因此，亟需开发出一种调控严谨、更加安全、且具有高度时空特异性的RNA碱基编辑工具。

2025年3月31日，来自华东师范大学的李大力团队在Nature Biotechnology上发表了题为Engineering a photoactivatable A-to-I RNA base editor for gene therapy in vivo的文章。他们开发了一种光激活RNA腺苷碱基编辑器（PA-rABE），该系统由mini dCas13X和光控Magnets系统驱动的分段ADAR2dd蛋白组成。在蓝光照射下，光敏蛋白二聚化带动分段ADAR2dd相互靠近恢复脱氨酶活性，从而实现时空特异性的RNA碱基编辑（图1a）。该研究采用的光控分段脱氨酶策略赋予PA-rABE高度光依赖性，不仅极大地降低了ADAR蛋白的转录组脱靶效应，还有效地规避了过表达外源ADAR蛋白带来的潜在致癌风险。通过AAV递送，PA-rABE成功修复了B型血友病小鼠的凝血功能，展示了其在精准基因治疗中的应用潜力。

为了评估RNA碱基编辑效率，研究团队构建了携带无义突变的Gaussia荧光素酶报告，简称Gluc W160X。对Gluc W160X转录本上的UAG进行靶向编辑可以将终止密码子转换为UIG从而在功能上恢复Gaussia荧光素酶的活性（图1b），通过检测荧光素酶的强度即可判断PA-rABE的编辑效率。为了获得编辑效率高且没有泄露的RNA碱基编辑器，该团队对PA-rABE系统中的Cas蛋白、ADAR2dd的分段位点、各基因元件的相对位置、linker序列、DR个数及Magnets突变体等进行了系统地优化。研究结果表明PA-rABE能灵敏地响应蓝光在细胞内实现可逆性的RNA编辑(图1c)，不仅具有高度的空间特异性(图1d)，还可以通过调节光照强度及时间灵敏地调控编辑活动的强弱(图1e,f)。

图1 PA-rABE系统的工作原理及特点表征。

与非诱导的RNA碱基系统相比，PA-rABE系统能高效地编辑内源RNA，在10 个内源转录本中的平均编辑率为34.7%，高于mxABE（~18.3%）和REPAIRv2（~23.6%），且在转录组水平具有高度特异性。光照条件下，其编辑效率是近期报道的光激活RNA碱基编辑器padCas13的2.1倍，转录组水平的脱靶事件仅为padCas13编辑器的2%。由此可见，光控分段ADAR策略不仅没有削弱脱氨酶活性，还通过光调控实现了对脱氨酶活性的严格监管，极大地降低了脱靶效应。此外，PA-rABE 联合特定的crRNA能有效地将单个或连续的双腺苷转化为肌苷，为含有提前终止密码子的遗传疾病提供了一种新的治疗方法。

为了探究PA-rABE在动物体内的编辑效率，该团队利用PA-rABE靶向外源Fluc W426X报告。该报告是一个失活的荧光素酶突变体，A>I碱基转换可以使 Fluc W426X的终止密码子UAG通读为UIG，从而在功能上恢复荧光素酶活性。活体成像结果表明，PA-rABE在光照条件下修复Fluc W426X产生的总荧光素酶强度是其在黑暗条件下总强度的66倍，是padCas13 编辑器在光照下的17.5倍，证明PA-rABE可以在体内实现高效且严谨的外源RNA编辑。为了进一步探究PA-rABE能否在体内编辑内源RNA，该团队将minicircle编码的PA-rABE和β-catenin驱动表达的报告（TCF/LEF-Fluc）一起注射到小鼠体内。光照条件下，PA-rABE靶向 CTNNB1，将第41位氨基酸由苏氨酸（T）转换成丙氨酸（A），使其编码的蛋白β-catenin在细胞质中免被降解，进入细胞核后激活TCF/LEF-Fluc表达。研究结果表明光照组小鼠的荧光素酶信号显著增强，荧光素酶活性是黑暗组的186 倍，证明PA-rABE能在体内精准地编辑功能性内源RNA。此外，该团队还将PA-rABE系统用于疾病治疗，通过AAV递送系统，PA-rABE成功地在光照条件下通读F9基因，修复了B型血友病小鼠的凝血功能，展示了其在精准基因治疗中的应用潜力，为精准调控治疗性转基因表达提供了概念验证。

Nature Biotechnology杂志同期配发了Research Briefing推荐了该团队的研究成果。编辑团队高度评价道：“该研究开发的PA-rABE系统在疾病治疗中具有潜在应用价值，尤其是在需要精细调控基因表达的治疗场景中，该工具有望根据不同疾病阶段或严重程度，实现精准的基因表达调控。”浙江大学平渊教授评论该工作：“PA-rABE 提供了一种具有时空特异性调控基因表达和功能的重要工具，在基础研究和疾病治疗中展现出广阔的应用前景。令人兴奋的是，研究者证明了 AAV 递送的 PA-rABE 能够改善 B 型血友病小鼠的凝血缺陷，进一步验证了其在基因治疗中的潜力。本研究不仅为 RNA 碱基编辑工具的开发提供了典型范例，还为实现疾病治疗过程中精准且可逆的基因表达调控这一重要目标提供了新的思路和解决方案。”

据悉华东师范大学副研究员李慧莹、博士研究生邱昱皓、硕士研究生宋博闻和权心怡为论文共同第一作者；华东师范大学为第一单位；华东师范大学李大力研究员、刘明耀教授和杜冰教授为共同通讯作者。

https://www.nature.com/articles/s41587-025-02610-2

Research Briefing链接：

https://www.nature.com/articles/s41587-025-02621-z

参考文献：

1. Teixeira, A. P. & Fussenegger, M. Synthetic Gene Circuits for Regulation of Next-Generation Cell-Based Therapeutics. Adv. Sci. 11, 1–24 (2024).

2. Song, J., Zhuang, Y. & Yi, C. Programmable RNA base editing via targeted modifications. Nat. Chem. Biol. 20, 277–290 (2024).

3. Booth, B. J. et al. RNA editing: Expanding the potential of RNA therapeutics. Mol. Ther. 31, 1533–1549 (2023).

4. Yu, J. et al. Programmable RNA base editing with photoactivatable CRISPR-Cas13. Nat. Commun. 15, 1–14 (2024).

5. Stroppel, A. S., Lappalainen, R. & Stafforst, T. Controlling Site-Directed RNA Editing by Chemically Induced Dimerization. Chem. - A Eur. J. 27, 12300–12304 (2021).

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