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膜蛋白约占细胞蛋白质总数的四分之一，是生物膜的重要组成部分，广泛参与各种生命活动。膜蛋白的生物合成和折叠对细胞功能至关重要，其功能障碍与诸多人类疾病息息相关。由于膜蛋白独特的疏水性，其合成过程受到高度调控，确保膜蛋白的新生肽链能够高效地从细胞质运输进入脂膜，并正确折叠成为有功能的膜蛋白。Sec复合物（Sec translocon） 作为最重要的膜蛋白转位机器 （protein translocation machinery） ，控制绝大多数膜蛋白的入膜通路，因此也被称为“膜蛋白之母”。Sec转位复合物的序列和功能高度保守，早在八十年代就通过遗传筛选被鉴定出来，原核细胞中定位在细胞质膜，被命名为SecY；真核细胞中定位在内质网膜，被命名为Sec61。在之后的几十年里，领域内对SecY/Sec61介导的蛋白转位机制进行了持续、广泛和深入的研究，形成了Sec复合物以门控通道的形式帮助膜蛋白进入细胞膜的共识。在转位过程中，细胞质中的核糖体与膜上的Sec结合，正在被合成的膜蛋白新生肽链出核糖体后立即进入Sec通道，然后被释放进入磷脂双分子层形成正确折叠的膜蛋白。然而在这一过程中，新生肽链的多次跨膜片段的顺序转位机制一直很不清楚，肽链运动与折叠的空间和时序关系一直困扰科学界：疏水的跨膜片段如何穿过狭窄的亲水通道并正确折叠？解开这些谜题的难点在于蛋白转位是一个瞬时且高度动态的过程。如何让蛋白转位运动慢下来便于深入研究呢？
北京大学生命科学学院李龙课题组长期致力于研究蛋白质转位的分子过程，重点发展技术平台，综合利用化学生物学、生物化学、生物物理和遗传筛选等技术手段捕获蛋白质转位运动的瞬时中间状态，在分子层面揭示蛋白转位过程的动态全貌。
2025年2月19日，李龙课题组与北京大学前沿交叉学科研究院定量生物学中心宋晨课题组及生命科学学院高宁课题组合作，在Cell期刊上发表了题为SecY translocon chaperones protein folding during membrane protein insertion的研究论文。该论文捕获了膜蛋白转位过程中的一系列中间状态，揭示Sec转位复合物在膜蛋白转运过程中不仅提供蛋白质穿膜的通道，更扮演“分子伴侣”的重要角色。研究结果第一次在分子水平揭示了膜蛋白转位与折叠的关系，提出“共转位折叠”的概念，为理解膜蛋白的生物合成提供了新的研究方向。
为了捕获膜蛋白转位的中间状态，李龙课题组在细胞内建立了蛋白转位复合物的组装体系，筛选合适的跨膜螺旋片段作为底物，利用绿色荧光蛋白 （GFP） 阻滞蛋白转位过程，同时通过引入二硫键交联、纳米抗体、以及纳米脂盘等技术稳定膜蛋白转位的中间态。与高宁课题组合作，利用冷冻电子显微镜技术，首次获得了跨膜蛋白转运中间态的高分辨率结构。结果显示，底物的第一个跨膜片段位于SecY通道外，以螺旋的形式插入脂质中，从外部打开SecY通道的侧门。第二个跨膜片段位于通道中，前半段呈现去折叠的展开状态；后半段在通道中以螺旋形式存在，代表在转位后期的折叠状态。宋晨课题组在此基础上系统性地利用分子动力学模拟，进一步证明了SecY通道前半段 （细胞质腔） 和后半段 （细胞外腔） 的结构分别为促进跨膜片段的展开和折叠创造了两种截然不同的物理化学环境，为SecY的“分子伴侣”功能提供了直接物质基础。更有趣的是，在两腔之间的孔环区域，底物肽段呈现伸展的螺旋状和锯齿状构象，这种展开的构象可帮助多肽底物通过狭窄的中心孔环。上述结果揭示了SecY在转位过程中对膜蛋白底物实施的“去折叠助运动”，以及“促折叠助释放”的精巧策略。
研究进一步以细菌视紫红质HmBRI为跨膜底物，捕获该膜蛋白在顺序转位过程中，第三个及第七个跨膜片段进入细胞膜的转位中间体。结果发现在SecY转位通道外侧与脂膜的交界面上存在一个 “亲水凹槽”，由数个高度保守的亲水氨基酸组成。由于该亲水凹槽深入疏水的脂膜，造成局部磷脂双分子层的变薄和破坏，为那些已经从通道释放，但是还未折叠的底物跨膜区段创造稳定环境。全新设计的蛋白转位双荧光报告实验和蛋白质组学分析表明，破坏该亲水凹槽导致膜蛋白在细胞水平出现全局性折叠缺陷，进一步证实SecY通道在膜蛋白折叠过程中的重要性。
图1 Sec复合物促进膜蛋白的跨膜及正确折叠
图左部为细胞内SecY介导的膜蛋白转位示意图；上部为放大的膜蛋白转位中间态示意图；下图为膜蛋白转位过程中SecY及膜蛋白底物局部细节图，红色虚线圈注SecY作为“分子伴侣”帮助膜蛋白底物入膜折叠的关键位点。
综上所述，这一系列实验结果揭示了Sec转运复合物前所未知的精妙组织方式，改写了对Sec功能的传统认知，提出Sec不仅仅只是被动的“蛋白通道”，更发挥不可或缺的“分子伴侣”功能，利用多种分子机理帮助膜蛋白入膜折叠。本研究为理解膜蛋白的转运机制提供了全新视角，并为研究膜蛋白折叠失衡相关的疾病提供了新的思路。
北京大学生命科学学院李龙研究员、高宁教授以及前沿交叉学科研究院定量生物学中心宋晨研究员为该论文通讯作者，李龙实验室欧晓敏，高宁实验室马成英博士，李龙实验室孙东杰、许金坤博士和宋晨实验室王洋博士为共同第一作者。李龙实验室吴晓飞、宋晨实验室王大力和杨嵩为该研究工作做出了重要贡献。北京大学生命科学学院昌增益教授对光交联实验提供了大力帮助。哈佛医学院Tom Rapoport教授对论文写作提供了重要指导。北京大学国家蛋白质科学中心张琪博士、刘栋博士，北京大学医学部刘小云研究员在质谱数据收集和分析方面提供了大力帮助。
https://doi.org/10.1016/j.cell.2025.01.037
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