Nat Genet | 全面分析9225种p53突变

撰文 | 雪月

p53 是一种主要的调控性转录因子，通过细胞周期阻滞、衰老和凋亡等机制抑制癌细胞的增殖能力。TP53 基因突变在约一半的癌症中被观察到，并且作为生殖细胞系突变，可导致 Li-Fraumeni 综合征。尽管 TP53 突变具有重要的预后意义，但由于其突变谱的复杂性，将其整合到临床决策中仍面临挑战。大多数 TP53 突变为错义突变，目前已鉴定出 2000 多种，主要集中在 DNA 结合结构域。尽管最常见且研究最深入的 10 种“热点”突变占病例的约 30%，但其余约 70% 的突变尚未被充分表征，导致难以准确预测其致病性和临床影响。

近日，来自德国菲利普大学的Thorsten Stiewe团队在Nature Genetics上发表了文章Deep CRISPR mutagenesis characterizes the functional diversity of TP53 mutations。本研究利用 CRISPR-HDR 进行大规模 TP53 突变筛选，系统解析了 9225 种突变对 p53 功能的影响，揭示其在癌症中的功能丧失、部分丧失和剪切异常，优化 TP53 突变的临床解读，为个性化癌症治疗提供新策略。

作者首先采用 CRISPR 介导的同源定向修复（homology-directed repair HDR）技术，在 HCT116 结直肠癌细胞中工程化 9225 种 TP53 突变体。使用 LoxP-Stop-LoxP（LSL）系统控制 TP53 的表达，并通过 Cre 介导的重组恢复突变 TP53 的表达。通过 Mdm2 抑制剂 Nutlin-3a（N3a）激活 p53 信号通路，评估不同 TP53 突变体对细胞增殖适应性的影响。通过高通量测序分析不同突变体的丰度变化，计算相对适应性评分。结果显示绝大多数癌症相关 TP53 突变导致 p53 失去抑制肿瘤的功能，使细胞在 Nutlin-3a 处理下仍能增殖。CRISPR-HDR 筛选有效地区分了功能正常（WT-like）、部分功能丧失和完全功能丧失的 TP53 突变。

接下来针对 TP53 最常见的突变位点 R175，作者构建包含 27 种不同突变类型（错义突变、无义突变、插入缺失等）的文库。通过 CRISPR-HDR 诱导突变，随后使用 Nutlin-3a 处理并监测突变体的生长优势。采用 RNA 测序分析不同突变体的转录组影响，并结合实时活细胞成像验证增殖能力。分析发现R175H 突变不会立即产生功能获得效应，但在长期体内传代后，突变细胞表现出更强的迁移、侵袭和转移能力。短期内，R175H 细胞的增殖能力与 功能丧失细胞类似，说明 功能获得效应效应需要长期适应。

作者接下来对TP53 DNA 结合结构域进行全面突变扫描。作者设计了 9225 个 DNA 结合结构域DBD 区域的突变体（包括错义突变、无义突变、移码突变等），涵盖 94.5% 的癌症相关 TP53 突变。通过 CRISPR-HDR 在 HCT116 细胞中引入突变，并使用 Nutlin-3a 处理，随后进行深度测序分析。计算每种突变的相对适应性评分，并与癌症数据库（TCGA、GENIE、ClinVar）中的突变频率进行比较。分析发现多数 TP53 突变导致功能丧失，但不同突变的影响程度不同。热点突变（如 R248、G245、R273）对 p53 结构的破坏性较大，而一些其他突变（如 R175、R282）则取决于具体的氨基酸替换类型。CRISPR-HDR 突变筛选可精确预测突变的致癌风险，并与患者突变频率呈高度相关性。

作者又检测 了TP53 突变对 p53 反应通路的影响。通过 Mdm2/Mdmx 抑制剂、DNA 损伤（放射、5-FU）、营养剥夺等多种条件，分析不同突变的功能变化。采用 FACS（荧光激活细胞分选）检测不同突变体的细胞凋亡情况。实验发现Mdm2 抑制剂（N3a）可用于筛选功能丧失突变，但对功能获得突变的鉴定有限。突变体对不同 p53 诱导信号（如 DNA 损伤、营养剥夺）的响应程度不同，其中 Nutlin-3a 处理最能区分突变影响。某些突变（如 R175T）在 N3a 诱导下快速凋亡，而其他突变（如 R175S）则主要通过细胞周期阻滞起作用。

作者检测了 TP53 突变的 RNA 剪切与无义介导衰变（NMD）效应。使用 CRISPR-HDR 在 HCT116 细胞中引入已知或预测的剪切位点突变，并进行 RNA-seq 评估 mRNA 水平。通过 qPCR 和蛋白质印迹检测 TP53 mRNA 和蛋白表达水平。采用 Nutlin-3a 处理细胞并测量增殖能力，以评估这些突变对 p53 功能的影响。结果显示部分 TP53 突变影响 RNA 剪切，导致无义介导衰变（NMD），从而削弱 p53 活性。例如 E224D、E224= 突变会破坏 RNA 剪切位点，导致 mRNA 降解或异常剪切，使 p53 失去表达。G199突变虽然是同义突变（不改变氨基酸），但它影响 RNA 剪切，导致 p53 功能丧失。CRISPR-HDR 可精确揭示剪切突变的影响，而传统 cDNA 过表达方法无法检测这些效应。

作者最后比较了 CRISPR-HDR 生成的 TP53 突变数据与传统 cDNA 过表达方法（Kotler, Giacomelli 研究）的结果。采用蛋白稳定性预测（HoTMuSiC）和热稳定性实验，评估部分功能丧失突变的影响。对比显示CRISPR-HDR 相比 cDNA 过表达筛选更敏感，可检测部分功能丧失突变。例如 V157L、T256A 等突变在 cDNA 过表达实验中表现为功能正常，但在 CRISPR-HDR 筛选中显示出部分功能丧失。这些突变导致 p53 轻度热力学不稳定，但在特定条件下（如低温或砷剂处理）可恢复活性，提示其可能是药物可靶向修复的突变类型。

总之，本研究通过 CRISPR-HDR 进行 TP53 饱和突变筛选，全面评估了 9225 种突变对 p53 功能的影响。该方法可用于优化 TP53 突变的临床解读，为个性化癌症治疗提供更精确的信息。

https://doi.org/10.1038/s41588-024-02039-4

制版人：十一

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