Nat Commun丨基因妙笔书生命，活鼠体内测天机

好书推荐！《动物行为实验指南》电子版pdf，网盘发货

《动物行为实验指南》共674页，涵盖了常见的实验动物，如小鼠、大鼠和斑马鱼，详细描述了每一种行为测试的实验设计、测试设备、实验流程、评估指标、预期结果、常见问题及解决方法、数据分析、模型应用与局限性等各个方面。它通过快速引导，帮助研究人员高效地掌握实验的每个阶段，减少了查阅文献和寻找方法的时间，成为各类科研人员的重要参考资料。 《动物行为实验指南》共计收录了16种动物行为类型，包括焦虑抑郁、学习记忆、痛觉、运动、恐惧、社交、癫痫、操作、成瘾、视觉、痒觉、味觉、嗅觉、睡眠、斑马鱼行为以及常见动物模型等内容。每一类动物行为下，都详细介绍了多个经典的实验范式，涵盖了超过100种实验方法。

由于缺乏高效的体内模型，对与先天性疾病相关的非编码变异进行功能分析仍然颇具挑战。

基于此，2025年1月6日美国加利福尼亚大学发育与细胞生物学系Evgeny Z. Kvon研究团队在Nature communications杂志发表了“Rapid and quantitative functional interrogation of human enhancer variant activity in live mice”揭示了在活体小鼠中对人类增强子变异活性进行快速且定量的功能探究。

在此，作者推出了一种基于Cas9的强大双色荧光报告系统（dual-enSERT），能够在不到两周的时间内，对活体小鼠体内的增强子等位基因活性进行快速、定量的比较。运用这项技术，研究并测定了此前与多指（趾）畸形、自闭症谱系障碍以及颅面畸形相关的增强子变异的功能获得和功能丧失效应。通过将dual-enSERT与单细胞转录组学相结合，描绘了增强子正常激活和异位激活时细胞中的基因表达特征，揭示了可能导致增强子调控异常的候选信号通路。最后，通过测试15个此前未被表征的、与神经发育障碍相关的罕见和常见非编码变异的影响，展示了dual-enSERT的广泛实用性。在此过程中，作者鉴定出了可重复改变OTX2和MIR9-2大脑增强子体内活性的变异，表明这些变异与自闭症有关。因此，dual-enSERT使研究人员能够在不到两周的时间内，从确定候选增强子变异进展到在活体胚胎中分析比较增强子活性。

图一 在发育中的小鼠胚胎中同时比较人类参考增强子与变异增强子的活性

经典的小鼠增强子-报告基因实验基于将转基因随机整合到基因组中。尽管传统的小鼠转基因技术是目前在体内可视化增强子活性的金标准，但由于位置效应会导致实验结果出现差异，并且需要培育大量转基因动物才能可靠地评估增强子活性。为了克服这些局限性，作者开发了dual-enSERT-1，这是一种转基因方法，基于高效的Cas9介导，将驱动荧光报告基因的增强子整合到H11安全港整合位点。一个增强子等位基因置于eGFP报告基因的上游，第二个增强子等位基因置于mCherry报告基因的上游，然后通过Cas9介导将每个转基因整合到H11基因座。创建了两个稳定的转基因小鼠品系，一个携带人类参考ZRS等位基因驱动mCherry表达（hZRSref-mCherry），另一个携带已知致病性404G>A变体驱动eGFP表达（hZRS404G>A-eGFP）。通过杂交使两种转基因在同一胚胎中共存，实现直接比较。在正常后肢芽区（ZPA）观察到mCherry荧光，与Shh表达一致；而eGFP荧光扩展到前肢区域，模拟多指畸形患者的异常现象。量化结果显示，在前肢中eGFP表达比mCherry强6.5倍，在后肢中强31倍，证明该系统能有效检测并量化致病变体对增强子活性的影响。针对自闭症谱系障碍和智力障碍相关的hs737增强子变体，构建转基因小鼠品系hs737ref-eGFP和hs737830G>A-mCherry。在中脑、后脑和神经管中观察到相似水平的荧光表达，但在前脑中hs737830G>A变体驱动的mCherry表达显著增加，证实了该变体的异常增强子活性。dual-enSERT-1系统通过高效整合到H11安全港位点，克服了传统随机整合方法的位置效应问题，能够稳健地检测和量化非编码变体对增强子活性的影响。该系统不仅适用于研究肢体发育异常相关的ZRS变体，还可用于探索其他先天性疾病相关的非编码变体，如自闭症谱系障碍和智力障碍中的hs737增强子变体。

图二 对自闭症谱系障碍患者未被表征的变异进行体内测试

为了功能筛选之前未表征的、与先天性疾病（特别是神经发育障碍，NDDs）相关的人类非编码变体，研究团队利用了dual-enSERT-2系统。该系统允许高效地评估这些变体对增强子活性的影响。通过整合GWAS和WGS研究中鉴定的数千个候选致病性罕见和常见非编码变体，并结合体内验证的人类和小鼠增强子数据，研究团队优先选择了14个罕见单核苷酸变体（SNVs）和一个常见的插入/缺失，分布在七个独特的活跃于前脑、中脑、后脑或神经管的增强子中。引入两个自闭症相关的罕见变体（435G>T和700C>T）导致显著的增强子活性丧失，特别是在大脑和神经管中。这两个变体破坏了保守的神经元表达转录因子TBX/TBR2和BCL11A的假定结合位点。OTX2中脑增强子的一个变体等位基因含有与自闭症相关的常见短串联重复（STR）多态性（rs1880784044），导致中脑增强子活性几乎两倍增加。四个增强子未检测到变化，一个增强子（hMM1518）在该检测中无活性，可能是由于物种间序列差异。总之，dual-enSERT-2系统是功能筛选非编码变体的强大工具，能够快速评估其对增强子活性的影响，从而揭示潜在的致病变体及其机制。

图三 单细胞分辨率下致病性增强子变异的活性

为了研究由增强子获得性功能变体引起的异位活性是否可以定量分配到特定细胞类型，研究团队使用了dual-enSERT系统。通过单细胞RNA测序分析，结合基因表达谱，研究揭示了哪些遗传通路可能导致增强子失调时的异位基因表达。对E11.5后肢芽进行scRNA-seq分析，分别来自F2 dual-enSERT-1和F0 dual-enSERT-2胚胎。hZRSref等位基因驱动mCherry，而hZRS404G>A等位基因驱动eGFP。采用嵌套PCR策略放大mCherry和eGFP转录本，减少报告基因丢失率。hZRS404G>A变体导致eGFP在远端中间、前侧和近端前侧间充质细胞中异位表达。正常和异位活性区域的转录谱高度相似，主要富集于间充质相关转录因子；异位活性细胞特异性表达少量基因如Asb4。该部分展示了dual-enSERT系统在细胞分辨率下捕捉变体等位基因标记细胞的能力，有助于深入理解增强子失调对基因表达的影响及其潜在机制。dual-enSERT系统不仅能够高效评估非编码变体对增强子活性的影响，还能在单细胞水平上解析其异位活性的具体细胞类型。

总结：

文章介绍了一种名为dual-enSERT的技术，可在活体小鼠中快速、定量地探究人类增强子变异活性。dual-enSERT技术能在两周内完成从鉴定候选增强子变异到分析活体胚胎中增强子活性的过程，为研究先天性疾病相关的非编码变异提供了高效方法。

文章来源

https://doi.org/10.1038/s41467-024-55500-7

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