Cell | 陈建军/邓晓岚/陈振华团队合作发现YTHDF2在B细胞肿瘤中的独特功能和靶向潜力

CD3-CD19双特异性T细胞衔接器 （贝林妥欧单抗） 和靶向CD19的嵌合抗原受体-T细胞 （CAR-T） 分别在2014年和2017年获得FDA批准上市，这不仅为B细胞白血病/淋巴瘤的患者带来了新的希望，同时也掀起了科学界利用T细胞治疗各类肿瘤和自身免疫相关疾病的研究热潮。多中心的临床数据显示，经过靶向CD19的CAR-T细胞治疗后，复发或者难治的 （R/R） B细胞急性淋巴细胞白血病 （B-ALL） 和B细胞淋巴瘤 （包括弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL），套细胞淋巴瘤（MCL）和滤泡性淋巴瘤（FL）等） 虽然取得了40%-81%的complete response rate，但是仍然有大约20%的病人不会缓解，而且超过50%的缓解病人在接受CAR-T细胞治疗仅1年以内就会复发。【1, 2】截止到2023年7月为止，多个不同临床研究中心的病人长期随访数据表明，五年无事件生存率在DLBCL患者中仅为31%，而在4-30岁的R/R B-ALL患者中更是低至25%。【3, 4】研究发现，最高有68%的B-ALL患者和28%的DLBCL患者在经历靶向CD19的T细胞治疗后，出现CD19抗原的低表达或者缺失，这被认为是长期缓解率偏低的重要原因之一。【5, 6】尽管后来又开发了双靶点的 （CD19+CD20或者CD19+CD22） 的CAR-T 细胞治疗方案，但是仍然有接近50%的R/R B细胞肿瘤患者会出现抗原逃脱的现象。【7, 8】此外，与髓系白血病细胞相比，恶性肿瘤B细胞分裂速度要快5-24倍。然而，快速增殖的B细胞的线粒体却仅有髓系白血病细胞大约一半的数量，且线粒体的体积也大概只有髓系白血病细胞的三分之一。【9, 10】所以，正常B细胞往往无法突破能量需求的阈值进行快速无限制增殖。研究表明，线粒体高效的合成ATP并提供能量是B细胞恶性转化和增殖的关键步骤。【9，10】因此，为了使CAR-T细胞治疗后的病人达到真正可靠的长期缓解，研究恶性B细胞抗原逃脱和线粒体高效产能的分子机制是至关重要的。

YTHDF2蛋白是第一个被鉴定的m6A修饰的识别蛋白。在很多不同的肿瘤中，这个RNA结合蛋白被报道发挥着重要的促癌或者抑癌作用。然而，到目前为止，还没有一个研究非常明确地指出究竟YTHDF2在哪一个癌症类型中最具转化潜力。更重要的是，YTHDF2蛋白通常被认为是通过识别m6A修饰后介导mRNA降解，然而在已发表的敲除或者敲低YTHDF2的RNA-seq数据中，存在着大量被下调表达量的基因。由于不能用YTHDF2识别m6A修饰后介导mRNA降解的分子机制去解释，这些基因往往被忽视。所以，YTHDF2是否可以不依赖m6A修饰直接正向调控非m6A修饰的靶基因表达尚不清楚，但很值得系统研究。

2024年12月17日，来自美国希望之城国家医疗中心贝克曼研究所的RNA研究与治疗中心主任、系统生物学系主任陈建军教授，邓晓岚研究副教授与陈振华博士共同在Cell发表题目为YTHDF2 promotes ATP synthesis and immune evasion in B-cell malignancies”的研究论文。文章首次揭示，YTHDF2促进了B细胞肿瘤的能量供应和免疫逃脱，并且在正常前体B细胞单独过量表达YTHDF2可以将其恶性转化为B-ALL细胞。YTHDF2识别 m5C修饰的mRNAs（例如ATPase 亚基b, f, g）并通过招募PABPC1促进靶基因的稳定从而提高线粒体ATP合成，以突破正常B细胞的能量障碍。同时，YTHDF2也可以识别并降解m6A修饰的mRNAs（例如CD19和HLA-DMA/B等）促进肿瘤细胞逃避免疫细胞的识别和攻击。利用小分子抑制剂CCI-38靶向YTHDF2不仅可以抑制恶性B细胞的生长而且可以显著地增强CD19 CAR-T细胞对复发B细胞肿瘤的疗效。（详见图1）

首先，作者对数千例B细胞肿瘤病人样本的RNA-seq或者microarray等多个数据库的数据分析发现，在所有经典的m6A修饰相关蛋白中， 只有YTHDF2在不同的亚型病人样本中显示出一致性地高表达且是最高表达的m6A修饰相关基因。尤其重要的是，在基于CRISPR-Cas9技术建立的DepMap数据库中，超过1000个不同类型肿瘤细胞的数据显示，对YTHDF2依赖性最显著的癌症类别是B细胞白血病和淋巴瘤。B细胞肿瘤病人的生存分析发现，YTHDF2的高表达往往预示着较短的生存时间。因此推测，YTHDF2是一个与B细胞肿瘤发生发展密切相关的m6A修饰蛋白。接下来，通过利用大量的细胞系、病人来源的异种移植细胞 （PDX） 细胞，BCR-ABL1或者NRAS(G12D)诱导的小鼠B-ALL细胞，作者验证了YTHDF2在B细胞肿瘤病人样本和细胞系中的的过量表达 （主要通过MYC, STAT3和POU2AF1转录激活表达） 而且发现YTHDF2是B细胞肿瘤体外恶性增殖和体内发病过程所必需的。过量表达野生型YTHDF2的健康小鼠前体B细胞可在小鼠体内发生恶性转化并发展为B-ALL细胞，虽然m6A结合能力完全缺失的YTHDF2突变体显著延迟了B-ALL转化和发病，但是最终还是会恶性转化，说明YTHDF2存在非m6A机制依赖的调控功能。

因此，在分子机制上，通过RNA-seq和m6A-RIP-seq的数据，作者首先分析发现， 有816个没有m6A标记的基因在敲低YTHDF2后出现显著下降的表达量。进一步功能和信号通路聚类分析发现它们显著聚焦到线粒体电子传递链的氧化磷酸化系统，包括一群在细胞核内转录但是蛋白定位在线粒体内膜的电子传递链中的ATP合成酶 （Complex V） 的基因，F-Type ATPase的亚基基因例如ATP5PB, ATP5MF, ATP5MG等。质谱定量测序细胞代谢物技术及相应的聚类分析、大量的B-ALL和DLBCL细胞系和PDX细胞的体内、体外功能实验研究，确定YTHDF2通过调控靶基因ATP5PB, ATP5MF和ATP5MG促进线粒体ATP产生和线粒体功能，从而促进B细胞肿瘤的发生发展。更进一步地，作者结合RIP 与UHPLC-QQQ-MS技术，精确定量了与YTHDF2结合的RNA上的各种甲基化修饰的丰度，结果表明，除了m6A 修饰的RNA之外，m5C修饰的RNA同样也显著地与YTHDF2蛋白结合。作者经过进一步的UHPLC-QQQ-MS，RNA pull-down实验，m5C-RIP-seq, Bisulfite-real-time PCR 联合第三代测序技术纳米孔测序 （nanopore-seq） ，基因位置分析等，证明了YTHDF2与m5C的亲和性，转录组基因结合位置的高度重合性，并解析了YTHDF2的RNA结合口袋中负责结合m5C的关键氨基酸位点和靶基因上被m5C修饰的单个C碱基位点。为了理解YTHDF2如何稳定m5C修饰的靶基因，作者发现在一项利用BioID技术研究细胞质亚结构中 （stress granule和processing body等） 蛋白质互作网络的研究中，11 YTHDF2与PABPC1可能互相结合，PABPC1曾被证明可以稳定mRNA的表达量，经典的m5C识别蛋白YBX1也正是通过招募PABPC1实现稳定mRNA的表达。12 有趣的是，在B细胞肿瘤中，PABPC1的基因和蛋白表达水平，生存分析，促癌功能，上游受到MYC等转录调控，下游调控ATPase家族基因/线粒体ATP生成等方面，均与YTHDF2非常地相关并表现出类似的功能。因此，YTHDF2识别m5C修饰的靶基因的mRNA并通过招募PABPC1稳定它们的表达，促进B细胞肿瘤的ATP合成和恶性增殖。这也解释了YTHDF2很可能通过提高线粒体产能效率，突破正常B细胞的为防止不可控增殖的能量屏障，造成正常B细胞的恶性转化。

同时，作者也观察到有1023个基因被m6A修饰且在敲低YTHDF2后上调表达量， 分析发现，YTHDF2识别并降解的m6A修饰的靶基因最显著地聚焦在B-cell-receptor signaling，Interferon Type I signaling和T细胞激活等通路，靶基因包括CD19和MHC-II 分子 （抗原呈递分子HLA-DMA和HLA-DMB） 等。敲低或敲除YTHDF2可以显著地上调细胞表面的CD19和HLA-DMA/B的丰度，进而提高贝林妥欧单抗和CD19 CAR-T 细胞对B细胞肿瘤的捕获和杀伤能力。作者研究发现小鼠Ythdf2缺失之后，不影响正常早期B和成熟B细胞分化、但是确实降低了Germinal Center的response，提高并激活了CD4+T 细胞等。同时，以前也有报道显示敲除YTHDF2可扩大正常造血干细胞比例。因此，YTHDF2应该是比较理想的治疗靶标蛋白。本研究开发的小分子抑制剂，CCI-38，选择性靶向YTHDF2（而不是YTHDF1或者YTHDF3） ，不仅单独处理就可以显著地抑制肿瘤的进展，而且还可以显著地增强CD19 CAR-T 细胞对T细胞治疗后复发的B细胞白血病（CD19low）的疗效。

来自美国希望之城国家医疗中心贝克曼研究所RNA研究与治疗中心主任和系统生物学系主任陈建军教授，邓晓岚研究副教授和陈振华博士为本文的共同通讯作者；来自美国希望之城国家医疗中心贝克曼研究所的陈振华博士，暨南大学血液学研究所/广州医科大学附属第五医院血液内科的曾成武教授，希望之城国家医疗中心贝克曼研究所的杨露研究副教授和车远博士为本文的共同第一作者；浙江大学免疫研究所、良渚实验室研究员肖刚教授、广州国家实验室研究员翁桁游教授和中山大学肿瘤防治中心黄慧琳教授等为该研究做出重要贡献。希望之城测序中心，希望之城质谱中心，UCLA质谱中心，UCLA代谢物测序中心，辛辛那提儿童医院的James C. Mulloy教授及耶鲁大学分子/细胞肿瘤中心主任Markus Müschen教授为该研究提供了关键的支撑和帮助。

图1. YTHDF2在B细胞肿瘤中促进ATP合成和肿瘤逃逸

https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(24)01324-2

希望之城国家医疗中心的陈建军教授和邓晓岚教授课题组长期致力于RNA和DNA表观修饰、恶性肿瘤发病机制、免疫治疗和小分子或蛋白降解药物开发等基础研究领域，已在Cell, Nature, Cancer Cell, Nature Biotechnology, Nature Genetics, Cell Stem Cell, Nature Cell Biology, Science Translational Medicine, Molecular Cell等期刊上发表一系列重要论文，近期招聘若干名有RNA研究、mRNA-based 治疗、肿瘤机制研究、肿瘤免疫、肿瘤代谢、和/或生物信息等背景的博士后研究人员和国际交流访问学者。热烈欢迎志同道合的年轻学者投递简历，招满为止。

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https://www.cell.com/cell/abstract/S0092-8674(24)01324-2

制版人：十一

参考文献

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