《Biomaterials》多伦多大学：水凝胶递送耐受性树突状细胞免疫调节治疗自身免疫性糖尿病

1型糖尿病（Type 1 diabetes，T1D)是一种自身免疫性疾病，由于胰岛素分泌β细胞的免疫耐受性丧失，导致淋巴细胞浸润和自身抗原特异性抗体产生，进而破坏β细胞，引起高血糖。T1D与MHC-II表达、抗原呈递细胞（如树突状细胞和巨噬细胞）的缺陷有关。传统治疗方法如β细胞替代（移植）虽有前景，但面临同种异体反应和再次被自身免疫系统攻击的风险。耐受性树突状细胞（Tolerogenic dendritic cells，tolDCs）作为一种新型治疗手段，通过扩增调节性T细胞（Tregs）和抑制抗原反应性免疫细胞，具有着低共刺激分子表达和高抗炎分子表达的特征，有助于在不引发炎症的情况下促进免疫耐受。近代研究中，甲基丙烯酸（MAA）基生物材料，特别是可注射的MAA-PEG水凝胶，作为组织工程的有力工具，已证明能促进血管化和组织修复，是T1D细胞治疗的有效载体。但如何更便捷更有效率的治疗T1D，仍是为当前研究的热点和挑战。

多伦多大学Michael V. Sefton教授及其团队研究了一种新的治疗T1D的策略，将MAA-PEG水凝胶作为tolDCs的移植支架，增强其在自身免疫性糖尿病中的免疫调节作用。同时通过维生素D3培养的耐受性树突状细胞（VDDCs）扩增抗原特异性Tregs并抵抗炎症。使得MAA-PEG水凝胶不仅作为VDDCs的传递载体，而且其固有的免疫调节特性能够进一步促进VDDCs的疗效。该研究成果以“Immunomodulation by subcutaneously injected methacrylic acid-based hydrogels and tolerogenic dendritic cells in a mouse model of autoimmune diabetes”为题发表在23年的《Biomaterials》上。

【制备方法】

1.可降解水凝胶的制备：将聚甲基丙烯酸钠（MAA）和八臂10 kDa聚乙二醇-丙烯酸酯（PEG-Acrylate）溶解在两性离子型生物缓冲剂（MOPS）中，缓冲pH为7.4，制备水凝胶前驱体溶液。降解约7天后，采用氢氧化钠与聚甲基丙烯酸共孵育，蒸馏水透析法制备聚甲基丙烯酸钠，再按比例混合水凝胶前体溶液与二硫苏糖醇（DTT），得到可降解水凝胶。

2.胰岛分离及胰岛裂解液的产生：从8周龄的正常血糖非肥胖糖尿病（NOD）雌性小鼠中获取胰岛。通过注射胶原酶（CIzyme RI, Vitacyte）使胰腺肿胀，然后在37℃下消化，使用隔离缓冲液洗胰岛，用组织膜分离，并用手采摘纯化。在含有热灭活胎牛血清和笔/链球菌抗生素的RPMI1640培养基中培养胰岛过夜。通过四次冻融循环产生胰岛裂解液，并通过离心去除碎片，得到产物。

3.骨髓衍生耐受性树突状细胞培养：骨髓取自8周龄正常血糖NOD雌性小鼠的胫骨和股骨。在含有FBS、pen/strep、GM-CSF和IL-4的RPMI1640培养基中培养8天，期间更换培养基。采用CD11c+磁珠分离纯化悬浮细胞，并在含有LPS和IFN-γ的培养基中进一步培养24小时，诱导树突状细胞成熟。在整个培养过程中添加1α,25-二羟基维生素D3（VD3）以产生耐受性树突状细胞（VDDCs）。在成熟期最后4小时用胰岛裂解液进行诱导。

【文章亮点】

1.MAA基水凝胶的免疫调节作用：使用了甲基丙烯酸（MAA）水凝胶皮下植入后，巨噬细胞和树突状细胞能被募集并激活，表现出更高的活化状态，有效驱动宿主的免疫反应。FoxP3+ CD4 T细胞被优先募集，可以在调节局部炎症和促进免疫耐受中发挥作用。MAA水凝胶作为耐受性树突状细胞（tolDCs）的传递载体，增强tolDCs治疗的效果，为治疗提供了新的途径。

2.VDDCs的协同作用：通过在皮下注射的MAA水凝胶中引入D3培养的耐受性树突状细胞（VDDCs），能够显著提升局部区域的免疫调节能力，并扩展了外周调节性免疫细胞的作用。这种联合疗法有效地降低了效应T细胞（涉及CD4和CD8细胞）的募集，同时保持了FoxP3+ T细胞的吸引，这有助于在植入区域营造一个更具有免疫耐受性的环境。此外，MAA水凝胶与VDDCs的结合使用，能够调节免疫反应，形成一种“免疫特权”的微环境，有助于对T1D的治疗。

3.VDDCs的迁移作用：迁移细胞会在淋巴结中与宿主接触，并引发感染性耐受型反应，有助于对抗自身免疫。宿主细胞在迁移到次要部位之前受到MAA调节的皮下植入物的影响，而通过迁移这些部位的VDDCs，有助于我们在MAA+VDDC植入物中观察到的外周免疫调节。

4.治疗新策略：研究中从MAA+VDDC植入物中看到的大量初始中性粒细胞募集可能反映了这种围术期炎症；这种中性粒细胞募集是对植入生物材料的反应所固有的。在未来的研究中，可以通过在水凝胶中加入抗炎生物制剂（以及其他成分）来减轻这种围术期炎症。

图1：皮下植入T细胞不同处理下产生的响应。

图2：皮下植入树突状细胞不同处理下细胞的响应。

图3：皮下植入巨噬细胞不同处理下细胞的响应。

图4：皮下植入后VDDCs的迁移和分布情况图。

图5：皮下植入含VDDCs的MAA-PEG水凝胶对淋巴结和脾脏中T细胞亚群的影响。

图6：第7天皮下淋巴结和脾脏中CD45+细胞的聚类分析。

图7：皮下注射VDDCs在可降解MAA-PEG水凝胶中对自身免疫性糖尿病的影响。

参考文献：

S. M. Kinney, K. Ortaleza, S.-Y. Won, B. J. M. Licht and M. V. Sefton.Biomaterials2023 Vol. 301, 122265

论文链接：

https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2023.122265