科学家开发无柱纯化高性能蛋白质制备方法，可用于研发酶制剂

近日，华南理工大学团队打造出一种名为 cSAT2.0 的重组蛋白无柱纯化技术，解决了标签重溶的问题，让无柱纯化能够达到 98% 的纯度。

它不仅适用于实验室水平，并能用于规模化的发酵罐生产和 96 孔板的高通量筛选。

cSAT2.0 在不使用色谱柱的情况下仍能获得达到 98% 的纯度，这主要得益于两个巧妙的设计。

首先，研究人员通过结合可自聚集的自组装肽和可自切割的内含肽建立了 cSAT1.0（即 cSAT2.0 的上一版本）。通过简单地改变 pH，就可以实现自切割的内含肽，这样一来就能对其进行定向进化改造，从而提高可控性和切割效率，由此所制备的目标蛋白具有天然序列，从而能在临床应用产生重要价值。

其次，研究人员在 cSAT1.0 中引入一个来自耐辐射奇球菌的蛋白酶前肽，借此有效阻止了标签重溶，从而能将纯度提高到 98% 甚至更高。

特别有意思的是，该团队发现来自其他物种的蛋白酶前肽并不能实现这一效果。其推测这可能是跟极端微生物为了抗逆而进化的一些蛋白序列特性有关。

理论来讲，本次技术适用于所有蛋白纯化制备与制造相关的应用，目前的技术成熟度大致是 5 级。眼下，该团队正在将本次技术推向工业规模的应用，并将在以下领域布局：

1、用于生物制药行业。目前越来越多的蛋白类药物包括多肽、抗体已被用于常见疾病和重大疾病的治疗，甚至也被用于减肥领域，相关市场呈现出快速增长的趋势。根据该团队的初步估算，采用 cSAT2.0 技术方案至少能比现有纯化方案节省一半的成本。

2、用于生物制造行业。酶广泛用于生物化工、化学医药制造和食品行业，而 cSAT2.0 特别适用于酶制剂和诊断试剂的研发与生产。

3、用于化妆品行业。近年来，重组胶原蛋白等在市场上的成功，带动了蛋白在化妆品日渐广泛的应用。有机构预测目前这一终端市场将能带来超万亿元的年销售额。而该团队的最新实验数据表明，cSAT2.0 技术同样适用于相关蛋白的规模制备。

4、用于蛋白药或靶点的筛选服务。由人工智能辅助的蛋白设计和药物开发，将成为生物医药研发的主流。而 AI 设计的蛋白需要高效的筛选技术来完成实验验证。目前，该团队已经证实 cSAT2.0 可以在 96 孔板上操作，其也相信 cSAT2.0 会成为这个领域的一个标准筛选技术，并能在抗体表位识别、药物靶点筛选、疫苗抗原开发等领域发挥作用。

近年来，该团队一直聚焦于合成生物学底层技术的研究。本项目则是围绕重组蛋白（酶）纯化与制造来开展的。

众所周知，蛋白纯化是生物技术的核心技术之一，也是新质生产力重要赛道生物制造与生物医药的重要引擎之一。

蛋白纯化长期面临着一个重大挑战：如何高效、低成本地把目标蛋白分离纯化出来？

现有的技术依赖多步的柱层析，效率低、耗时长、成本高，这在规模生产中尤为突出，但一直无法突破。

大约 14 年前，该团队意外发现某些自组装短肽能让目标蛋白特异性形成沉淀聚集体，与表达宿主的其它杂蛋白分开，而且能够保持完全的生物活性，且通常并不减少其表达量。

基于此，课题组结合成熟的自切割内含肽，设计了一种可切割自聚集标签的蛋白纯化技术，并将其称之为 cSAT（cleavable self-aggregating tag），借此建立了一种上述的重组蛋白无柱纯化技术。

但是，其也发现目标蛋白在自切割之后，总是有小部分的 cSAT 标签会因为重溶而污染目标蛋白，导致最终纯度一般在 80-90%。多年来，其一直在努力解决这个问题。

该团队原先的设计是将一个具有双亲性的短肽，即将一个兼具亲水部分和疏水部分的短肽，与一个目标蛋白融合表达，用于蛋白质工程改造。

后来，课题组的博士生吴伟发现融合蛋白在表达之后都变成沉淀了。一般情况下，表达后形成沉淀（通常称之为包涵体）的蛋白，是没有活性的。吴伟对此感到非常沮丧，当天中午连午觉都没有睡，喝了一杯咖啡之后，回到实验室干脆不管三七二十一，测了一下蛋白活性。结果发现蛋白不仅有活性，而且与野生型相当。正是这一意外，让该团队发现并开创了 cSAT1.0。

而 cSAT1.0 自聚集标签部分重溶问题，多年来都没有太好的解决办法。后来，课题组负责人林章凛从清华大学调到华南理工大学，并和杨晓锋副教授组成团队。课题组经过多次讨论之后认为，标签重溶可能是因为自组装肽的组装导致的空间挤压。

由此，他们设想是否可以在 cSAT1.0 标签中加一段多肽，借此增加自组装肽的空间，从而使 cSAT 标签不再重溶。

这期间，该团队一直承担国家 973 和重点研发专项合成生物学项目工作，涉及微生物和植物抗逆的人工元器件和基因回路设计。

在这十多年项目执行中，他们认识了几位长期紧密合作的伙伴，其中就有来自中国农科院生物技术的合作者。后者长期研究耐辐射奇球菌，发现其许多蛋白能够用于提高作物的耐旱耐盐碱性能。

在此基础之上，该团队提出：是否可以在 cSAT1.0 标签中加入一段来自耐辐射奇球菌的肽段？

后来，华南理工大学博士生黄源牵头做完了这个实验，并得到令人惊喜的纯化结果，发现前肽能够完美解决课题组一直要想解决的标签部分复溶问题。

最终，相关论文以《一种单步无柱的高性能蛋白质制备方法》（A high-performance protein preparation approach in a single column-free step）为题发在Trends in Biotechnology（IF 14.30）。

黄源是第一作者，林章凛教授（目前任职广东工业大学）和华南理工大学杨晓锋教授担任共同通讯作者 [1]。

目前，该团队已经在筹建公司来推进技术产业化。另外，在筛选应用上他们正在结合 AI 辅助的蛋白设计，实现数据与制备技术双驱动的蛋白质工程。

当前，cSAT2.0 主要用于大肠杆菌的蛋白表达系统，基于这一技术框架，还有望用于其他表达体系，比如用于酵母、哺乳动物细胞体系的蛋白纯化技术。

研究人员补充称：“回顾来看，一共有近十位的博士生以及多位硕士生参与了整个技术的建立。”

他们表示，中国已经是一个经济大国，因此也有责任成为一个科技大国。这种情况下在生物技术领域，聚焦解决重大的底层技术问题，应该是科研人员的重要使命之一。自 1973 年以来，在现代生物技术发展历史上，基因工程、聚合酶链式反应、蛋白定向进化等技术的研究者，不仅有多位获得了诺贝尔奖，同时这些技术也极大推动了生物技术、经济和社会的发展。

因此，该团队也将继续致力于类似 cSAT2.0 的底层技术。最近，他们在 AI 辅助的蛋白挖掘与进化上也做出了一些不错的结果，前者的相关论文已经发表于Cell Reports，后者的相关论文很快就要进入投稿流程。

参考资料：

1.Huang, Y., Zhang, Y., Yang, X., & Lin, Z. (2024). A high-performance protein preparation approach in a single column-free step.Trends in Biotechnology.

排版：初嘉实