靶向铁死亡！上海交通大学王伟铭团队：有前景的肾病治疗新策略

【导读】糖尿病肾病（DKD）是一种常见的糖尿病并发症，以肾功能进行性下降和缺乏有效的治疗方案为特征。

10月23日，上海交通大学王伟铭研究团队在期刊《Cell Death Discovery》上发表了研究论文，题为“C/EBPα-mediated ACSL4-dependent ferroptosis exacerbates tubular injury in diabetic kidney disease”，本研究中，研究人员研究了转录因子CCAAT/增强子结合蛋白α (C/EBPα)在DKD发病机制中的作用。肾活检标本分析显示，DKD患者C/EBPα表达增高。通过RNA测序和蛋白质组学，研究人员探索了C/EBPα在DKD中的作用机制。研究结果表明，C/EBPα通过促进ACSL4依赖的铁死亡来加重肾小管损伤。研究人员发现C/EBPα通过与ACSL4的转录调控序列（TRS）结合来上调ACSL4的表达，导致脂质过氧化和铁死亡的升高。此外，抑制或基因敲除C/EBPα可减轻DKD中铁死亡和肾小管损伤。这些结果表明，C/ ebp α- acsl4 -铁死亡通路是DKD治疗的一个有前景的治疗靶点。

https://www.nature.com/articles/s41420-024-02179-w

背景信息

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糖尿病肾病（DKD）是一种作为糖尿病并发症出现的肾脏疾病，给医疗保健带来了巨大负担。其特征是肾脏血管损伤，导致蛋白渗漏、高血压和肾功能下降。虽然代谢紊乱和炎症浸润与DKD进展有关，但驱动其进展的主要因素和潜在机制仍在研究中。

近期的研究强调了C/EBPα（CCAT/增强子结合蛋白α）在DKD（矿物质和骨质代谢紊乱）进展中的作用。C/EBPα是CEBP家族的成员，含有一个基本区域亮氨酸拉链（bZIP）结构域，并根据CEBPA mRNA的翻译起始位点产生两种异构体，p42和p30。p30异构体主要抑制终末细胞分化，而p42异构体调节细胞增殖和分化。C/EBPα已知参与髓系细胞分化、急性髓系白血病（AML）以及各种代谢过程，尽管其详细机制尚未完全阐明。

铁依赖性细胞死亡过程——铁死亡（ferroptosis）的特点是脂质过氧化物的积累。研究强调了脂质代谢稳态在保护DKD患者肾脏功能方面的重要性，其中ACSL4介导的脂质过氧化和活性氧（ROS）释放是关键因素。

特异性地敲除C/EBPα基因可减轻DKD小鼠的铁死亡现象

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研究人员进一步的研究涉及C/EBPα诱导剂ICCB280和RNA测序，提示C/EBPα可能参与了铁死亡途径。这一发现得到了DKD野生型小鼠观察结果的支持，这些小鼠的线粒体出现皱缩，嵴结构紊乱，并且出现了丙二醛（MDA）水平升高的现象。此外，与KO小鼠相比，DKD野生型小鼠中将谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）这种将二硫键还原为谷胱甘肽的关键酶的表达显著降低。值得注意的是，各组GPX4 mRNA水平没有显著差异，这表明表达量降低是由于功能性降低而非转录调控。4-羟基壬烯（4-HNE）是一种脂质过氧化产物，免疫荧光染色显示DKD野生型小鼠肾脏中4-HNE的荧光强度显著增加。这些发现证实了C/EBPα在铁死亡过程中的关键作用。

C/EBPα缺乏通过下调ACSL4减轻了DKD中的铁死亡

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为了探究C/EBPα对铁死亡的影响所涉及的关键分子，研究人员对患有糖尿病肾病（DKD）的小鼠肾脏组织和未经治疗的Cre+/Cebpa+/+（野生型）小鼠肾脏组织进行了串联质谱（TMT）蛋白质组分析。研究人员重点关注与铁死亡途径相关的蛋白质，并鉴定出在DKD中升高的蛋白质。所得的热图显示，在DKD小鼠的肾脏组织中，关键酶ACSL4（由C/EBPα调节，参与PUFA-CoA形成）的蛋白质水平显著升高。对中长链脂肪酸的代谢组分析显示，DKD野生型小鼠肾脏中的亚油酸（ACSL4的底物）水平降低，而DKD敲除小鼠肾脏中的亚油酸水平升高，这表明ACSL4表达在肾脏中存在相反的影响。这些发现通过蛋白质免疫印迹实验分析得到验证，结果显示敲除小鼠肾脏中的ACSL4蛋白水平明显低于野生型小鼠。此外，qPCR和免疫荧光染色证实，DKD野生型小鼠肾脏中ACSL4 mRNA表达和平均荧光强度显著增加，而在DKD敲除小鼠中，水平保持稳定且较低。

C/EBPα 过表达通过上调 ACSL4 加剧了 DKD 小鼠的铁死亡

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为了研究C/EBPα在肾脏皮质中的过表达对糖尿病肾病的影响，研究人员利用AAV9载体建立了Cebpa过表达动物模型，并评估其对DKD小鼠肾脏功能的影响。研究结果显示，AAV9-Cebpa载体注射导致DKD小鼠Cebpa和Acsl4 mRNA水平升高，同时伴有尿素氮、血清肌酐、UACR和MDA浓度升高。此外，研究人员观察到AAV9-Cebpa组小鼠有更严重的肾脏损伤、纤维化和炎症细胞浸润。另外，Cebpa过表达小鼠肾脏中Lcn2、纤维化相关因子的mRNA表达显著增加，Acsl4、纤维连接蛋白和4-HNE水平显著升高。这些结果表明，在肾脏皮质中上调C/EBPα调节Acsl4表达并加剧铁死亡，从而导致DKD小鼠肾脏损伤。

C/EBPα缺乏通过下调ACSL4减轻PTECs中的铁死亡

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研究人员对WT和KO小鼠的PTEC进行了检测，观察到KO PTEC中CEBPA和ACSL4的蛋白质和mRNA水平显著降低。此外，在RSL-3刺激下，KO PTEC的细胞存活率更高。在30 mM D-葡萄糖的刺激下，KO PTEC中谷胱甘肽（GSH）的水平升高，流式细胞术检测到的C11-BODIPY和Liperofluo的荧光强度降低。与WT PTEC相比，KO PTEC在AGE刺激下的C11-BODIPY荧光强度降低。这些发现表明，C/EBPα在调节PTEC中的ACSL4表达和铁死亡方面发挥着关键作用，C/EBPα敲除可提供对抗氧化应激损伤的保护。

C/EBPα通过上调ACSL4诱导管状上皮细胞发生铁死亡

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为了进一步验证假设，研究人员使用ICCB280诱导PTECs中C/EBPα的表达。qPCR分析显示，在50 μM ICCB280刺激下，PTECs中Cebpa和Acsl4 mRNA表达显著上调。细胞存活性试验表明，PTECs在ICCB280处理后表现出剂量依赖性的存活率降低，在50 μM ICCB280处理组中观察到的存活率降低了50%。使用Liperofluo（一种专门用于脂质过氧化的探针）和C11-BODIPY（一种脂质过氧化探针）进行流式细胞术分析显示，在ICCB280刺激后，两种探针的平均荧光强度均出现了显著变化。此外，ICCB280治疗显著降低了PTECs中的GSH浓度，并显著增强了MitoSOX的荧光强度，表明发生了铁死亡。这些发现进一步证实，在C/EBPα诱导下，PTECs的4-HNE产生量高于DMSO对照组。

C/EBPα通过上调ACSL4诱导管状上皮细胞发生铁死亡

结论

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总之，本研究揭示了C/EBPα在DKD中通过直接与ACSL4转录调控位点结合来调节其表达而发挥的新作用，从而导致肾小管损伤。岩藻甾醇可以抑制C/EBPα，这意味着它是预防DKD肾功能衰竭的一种新的靶点。

【参考资料】

https://www.nature.com/articles/s41420-024-02179-w

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