JPA中科院1区：天然产物虚拟筛选-相互作用-表型的靶标鉴定策略—以丹参改善缺血性中风为例

天然产物（NPs）历来是药物发现的基本来源，由于化学结构和潜在的药用潜力，NP仍然是药物开发不可或缺的一部分，如青蒿素、长春新碱和青霉素，均已取得广泛的临床应用。尽管如此，这些分离和纯化的单一组分仅占NP的一小部分，通常NP以复杂混合物的形式存在。表征和发现NPs的活性成分，特别是阐明其作用机制，仍然是该领域的一个重大瓶颈。此外，鉴定靶蛋白或细胞信号通路对于了解NP的生物学功能和药理机制至关重要。NP的复杂性为确定生物活性成分和相应的靶标带来了重大挑战，因此，开发适合NP的复杂性及其潜在的多途径效应的靶标识别方法至关重要。

2024年9月16日，浙江大学药学院徐腾飞团队在J Pharm Anal上发表了题为“Natural Product Virtual-Interact-Phenotypic Target Characterization: A Novel Approach Demonstrated with Salvia Miltiorrhiza Extract”的文章，提出了一种创新的天然产物鉴定方法，并以丹参（SM），一种公认的对缺血性中风（IS）具有治疗潜力的草药，用于演示工作流程，揭示了其在缺血性脑卒中治疗中的潜在靶点。文章结合了虚拟筛选、化学蛋白质组学和代谢组学等多种先进技术，提出了一个创新的虚拟筛选-相互作用-表型（NP-VIP）研究策略，显著提高了靶点鉴定的准确性与效率。该研究不仅强调了SM在治疗IS中的重要性，还为NP研究开创了先例，提出了一种可以适用于更广泛的药理学探索的综合方法。

1、丹参提取物（SME）的化学分析

为了全面鉴定SME的化学成分，研究采用了正交液相分离方法。首先使用正相硅胶柱色谱根据极性将SME分离成10个馏分，然后使用反相C18柱色谱进一步分离这些馏分。随后，使用UPLC-MS/MS对每个馏分进行组分鉴定。通过文献综述和串联质谱解释进一步分析SME的化学特征。为了证明鉴定化合物之间的片段相似性，采用了GNPS分子网络算法，并使用Cytoscape软件将结果可视化，在SME中发现了10个主要簇 （例如，苯丙烷类和聚酮类由31 种化合物表示，特别是丹酚酸B;低聚糖化合物由60个节点表示，水苏糖为核心物质;脂质和脂质样分子簇包含62个节点，具有丹参酮 IIA 等典型化合物。这些成分是SME中已知的活性成分，对心血管保护、抗炎、抗氧化等方面具有显著的药理作用。在这项对SME的全面化学分析中，共鉴定出151种化合物，支撑材料列举了SME中所选代表性化合物（丹酚酸C、丹酚酸B、迷迭香酸）的离子碎片匹配信息。这是迄今为止在一项研究中报道的SME的最广泛的表征（图1）。

图1 采用UPLC-MS/MS对表现出不同极性的SME组分进行表征，随后通过GNPS进行聚类

2、验证SME对缺血性中风的体外和体内疗效

为了评估SME对IS的疗效，研究采用了体外和体内模型。体外实验在PC12细胞中使用OGD/R模型，而体内实验采用大鼠永久性大脑中动脉闭塞（pMCAO）模型，使用多个指标评估SME对IS的预防和治疗效果。在体外实验中，用SME预处理PC12细胞24 h，然后进行2 h OGD建模和24 h再供氧，然后进行CCK-8测定以评估SME对OGD诱导的PC12细胞的增殖作用。体外实验结果显SME对缺氧缺血性损伤发挥线粒体保护作用，从而提供神经保护。体内实验结果显示SME预处理减少大鼠脑中的缺血损伤，减轻了组织坏死，维持了细胞完整性，并减少神经元凋亡。这些全面的体外和体内实验为SME对IS损伤的神经保护作用提供了有力的证据，验证了其治疗IS的潜在治疗效果（图2）。

图2 通过使用氧-葡萄糖剥夺（OGD）诱导的PC12细胞和大脑中动脉闭塞（MCAO）大鼠模型的体外和体内实验证实了丹参提取物（SME）的神经保护作用

3、丹参提取物（SME）的虚拟筛选和靶标预测

虚拟筛选（VS）是一种计算方法，它利用计算机模拟来快速且经济高效地预测大量化合物与生物靶标之间的结合相互作用，从而加速药物靶标发现过程。作者采用VS技术获得SME中生物活性化合物的综合靶标信息，同时考虑其结构和生物活性特性。药物开发的Chemical Checker（CC）平台提供了一个全面的数据集成框架，通过将CC基于深度学习的多维相似性分析应用于SME化合物，发现了SME中的两种关键化合物丹酚酸C和丹酚酸B之间的结构和物理化学相似性，以及它们在与其他相关分子结合后的共同靶标。通过整合基于结构相似性筛选和多维生物相似性分析得到的靶点信息，共鉴定出126个SME化合物的281个潜在靶蛋白。此外，该研究使用“缺血性中风”作为关键词，将已确定的潜在靶点与 DisGeNET 数据库进行交叉分析，以确定与该疾病治疗相关的重叠靶点。这种全面的方法导致确定了29个可能涉及SME对抗IS的作用机制的共同靶标（图3）。

图3 采用虚拟筛选来确定SME的靶标群体

4、虚拟筛选靶点的富集分析和分子对接

为了根据SME成分的结构和生物学相似性对确定的靶点进行比较分析，该研究对两组靶点进行了GO富集分析，同时该研究对结构和生物学相似靶点与IS相关靶点交集的29个重叠靶点进行了富集分析，发现SME 可能通过调节炎症反应、细胞外基质和丝氨酸水解酶活性来影响IS的进展。此外，对29种潜在靶蛋白进行KEGG富集分析，血清素能突触功能通路中 ALOX12、ALOX5、ALOX15、APP和PTGS2的富集，以及花生四烯酸代谢中PTGS2、ALOX5、ALOX15和ALOX12的富集。随后，29 种靶蛋白的PPI分析表明，APP、STAT3、PTGS2、MMP9 和 MMP2是最中心和高度连接的蛋白质，表明它们的关键生物学功能，为了进一步评估 SME 化合物与29种靶蛋白之间的结合相互作用，作者进行批量分子对接。发现ACHE、NOS2、PARP1 和 TNKS 通常与 SME 组分具有很强的结合相互作用。在 SME中鉴定出的151种化合物中，有126种被分配了 CID 编号，计算22种蛋白质与天然底物的对接分数，比较SME中蛋白质、天然底物和小分子之间的结合亲和力。值得注意的是，与其天然底物相比，SME化合物芹菜素与APP的结合更强，表明蛋白质功能的潜在竞争性结合和调节（图4）。

图4 采用富集分析和分子对接进一步验证通过虚拟筛选确定的靶点

5、使用PISA方法鉴定SME的直接互作靶蛋白

为了有效地筛选与SME中的生物活性化合物结合的蛋白质，作者研究采用了一种简化的CETSA方法PISA。PISA程序包括将细胞裂解物与SME一起孵育，然后进行加热处理，然后进行TMT蛋白质组学分析，鉴定出2411种蛋白质，其中1468种含有两种以上的独特肽，表明数据质量高。采用标准（FC≤0.667或≥1.5，P<0.05）最终获得了100种差异蛋白，其中86种在处理后表现出显著增加的热稳定性。重要的是，先前从VS中确定的目标 APP也被发现具有更高的热稳定性（FC=1.545，P=0.04）。鉴定的靶蛋白的功能分类显示与自噬通路相关的蛋白质显著富集，KEGG 通路分析证实了这一点。此外，GO分析突出了突触后膜蛋白在已确定靶标中的富集。这些发现表明，SME 可以通过调节神经递质受体表达和影响线粒体生物能量学来积极影响神经元存活和功能，这与TEM分析结果一致。电子显微镜图像显示，在 SME 治疗后，线粒体损伤得到了部分修复，与OGD/R组相比，所得的形态更接近正常细胞外观，表明潜在的治疗效果（图5）。

图5 使用PISA方法鉴定SME的直接互作靶蛋白

6、通过多剂量代谢组学鉴定SME的靶蛋白

与小分子非共价结合的靶标表现出微弱或瞬时相互作用，这使得鉴定具有挑战性。然而，这些相互作用可以通过表型变化来推断。在这种情况下，代谢组学通过识别药物诱导的代谢变化来提供直接和实时的见解，从而阐明药理学作用机制。作者通过代谢组学发SME对PC12细胞代谢有重大影响。The ED50对于特定的药物反应，可以通过筛选随SME剂量变化的代谢物来确定。这些结果表明，SME在较低浓度下有效抑制OPLAH酶活性，导致焦谷氨酸积累和 L-谷氨酸产生减少。然而，由于GAD67活性增加或在较高 SME 浓度下表达，GABA生成可能得以维持。此外，参与GLUL和SMS介导的可逆反应的代谢物，如 L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、亚精胺和精胺，均表现出相似的 EC50值，证实了这些代谢过程的可逆性质（图6）。

图6 通过多剂量代谢组学分析鉴定剂量反应性代谢酶

7、SME调节的剂量依赖性代谢酶的生物信息学分析

通过预归一化和剂量反应趋势代谢物绘图，分别在正离子和负离子模式下检测到749个和953个剂量改变离子，其中82个离子被进一步鉴定为代谢物。使用 MetaboAnalyst 平台进一步分析 82 种剂量改变的代谢物，确定与78种代谢酶靶标的关联。82 种代谢酶的富集分析，发现前8名KEGG代谢途径。和弦图对代谢途径进行颜色编码，并通过带状连接线将它们与特定酶联系起来，强调了代谢酶参与的复杂相互作用网络和重要途径。例如，核苷酸代谢途径包括 CDA、CTPS1和DCK等18种酶，而丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢途径包括 GLUL、GAD67和GLS等13种酶，揭示了生物途径中代谢物和酶之间的相互作用和功能关系。此外，78 种代谢酶的PPI网络揭示了这些酶之间错综复杂的相互作用，分析突出了一个由9种高度互连的酶组成的绿色簇，其中GLUL作为中心节点（图7）。

图7 通过多剂量代谢组学分析鉴定剂量反应性代谢酶及其综合生物信息学分析

8、验证 SME 和靶蛋白之间的相互作用

在通过三种方法识别各种靶点之后，整合和选择合适的验证靶点是VIP方法的关键步骤。GO分析揭示了BP中氨基酸代谢过程和磷酸核苷代谢过程中的重要作用，突出了氨基酸转化和核苷酸代谢在SME介导的神经保护作用中的重要参与。此外，氧化应激反应和金属离子结合的调节强调了神经元细胞应对氧化应激和离子失衡的适应机制，这在IS的背景下很常见。这强调了SME在减轻细胞损伤方面的药理作用。MF分析强调了蛋白质合成和修复在介导SME的药理作用中的关键重要性。KEGG通路富集分析揭示了与卒中病理密切相关的几种代谢途径，包括嘧啶代谢、谷胱甘肽代谢、辅因子的生物合成和 HIF-1 信号通路等。这些发现表明，这些途径可能显著有助于SME对缺血性脑损伤的潜在保护作用。ALB、 STAT3、ESR1、GLUL、APP、GAD67和PARP1等蛋白在PPI网络中表现出更高的程度，表明SME对IS的调节参与度更高。

使用生物信息学和系统分析，选择了一组与IS的SME治疗相关的蛋白质。选择通过各种靶标筛选方法鉴定的5种蛋白，包括STAT3、PARP1、APP、GAD67和GLUL，它们是PPI网络的核心，用于实验验证。随后，采用DARTS技术结合 WB分析来验证和量化SME组分与潜在靶蛋白的直接结合。实验结果显示，在 0.1、0.5 和 1.0 mg/mL的SME剂量下，GLUL、GAD67、STAT3、APP和PARP1的表达水平呈剂量依赖性增加，证实了 SME 的活性成分与这些蛋白质的特异性结合相互作用。

进行了分子对接实验，以研究SME 中鉴定的 126 个小分子与5个靶蛋白 （APP、GLUL、STAT3、GAD67和PARP1） 之间的相互作用。为了验证分子对接结果并评估蛋白质-配体结合稳定性，对对接分数最低的蛋白质-小分子复合物进行了分子动力学模拟。结果发现APP 与芹菜素、GAD67 与齐墩果酸、GLUL 与丹酚酸 A、PARP1 与丹酚酸 C 以及 STAT3 与齐墩果酸的结合稳定性，这种稳定性表明蛋白质和小分子之间存在特定的相互作用力（图8）。

图8 对NP-VIP方法筛选的靶点进行综合分析，并实验验证SME与靶蛋白之间的相互作用

总结

利用虚拟筛选、化学蛋白质组学和代谢组学，确定了IS治疗中SM的潜在治疗靶点，总数分别为29、100和78个。通过 NP-VIP策略进行进一步分析，突出了五个高置信度靶点，包括PARP1、STAT3、APP、GLUL和GAD67。这些靶点随后得到验证，发现在SM的神经保护作用中起关键作用。

研究采用了全面的NP-VIP方法，强调了SME治疗IS的疗效。这种创新方法整合了VS、PISA和多剂量代谢组学，在SME中成功识别和验证了多个生物活性靶点，显著提高了精度并降低了通常与传统单一方法方法相关的错误率。

这些发现不仅证实了SME的神经保护特性，而且还为NP研究建立了一个强大的框架，有望增强药物发现和治疗开发。NP-VIP方法在NP靶材中显示出有前途的应用。基于其作用机制，该方法还可以应用于其他单体化合物的靶标鉴定，使其成为药物开发的有力工具。此外，这种方法也可以用于其他学科，例如毒理学和环境暴露组靶标组分析。

图9 天然产物虚拟筛选-相互作用-表型分析 （NP-VIP） 的标准工作流程。

关键步骤涉及天然产物的提取和表征、使用计算机确定潜在靶组、化学蛋白质组学和多剂量代谢组学方法。

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