高性价比2区: 贵中医大基于蛋白质组学和生物信息学探究土茯苓治疗高血压的分子机制

微科盟原创微文，欢迎转发转载。

导读

土茯苓（SGR）具有药用和食用价值，特别是在抗炎和治疗免疫系统疾病方面具有明显的药理活性。本研究应用蛋白质组学和生物信息学研究了SGR治疗高血压患者的差异蛋白表达及其与免疫浸润的关系。采用N-硝基L-精氨酸甲酯（L-NAME）构建高血压模型，灌胃给予SGR 4周，每7天用尾袖法测定各组大鼠的收缩压和舒张压。此外，使用酶联免疫吸附测定法（ELISA）测定各组血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白蛋白胆固醇（HDL-C）的表达，然后使用串联质量标签（TMT）技术检测大鼠肝脏样品中的蛋白质表达。Cytoscape 3.9.1软件给出hub靶点，并通过ELISA检测各组大鼠肝脏和血清中ALDH2的表达。此外，使用R4.3.0软件评估乙醛脱氢酶2（ALDH2）与免疫细胞之间的关系，并进行超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）鉴定SGR的成分。利用分子对接和LigPlot1.4.5软件分析了SGR和ALDH2成分之间的关联。结果发现，与模型组（L-NAME）相比，高、中剂量SGR降低了高血压大鼠的收缩压和舒张压，同时降低了TC、TG和LDL-C水平，增加了HDL-C水平（p<0.05）。此外，使用TMT鉴定了92种差异表达蛋白（DEP）。这些DEP参与过氧化物酶体功能、脂肪酸降解和其他信号通路，ALDH2是核心靶点，并与各种免疫细胞相关。在SGR中测定了18种成分，其中8种化合物与ALDH2结合。分子对接确认SGR基于多种成分的结合在高血压中发挥作用。SGR对L-NAME诱导的高血压具有降压作用，以ALDH2为关键靶点。SGR可以通过靶向ALDH2来调节中性粒细胞、调节T细胞和其他细胞的浸润，从而有助于高血压的治疗。

图文摘要

论文ID

原名：Investigation of the molecular mechanism of Smilax glabra Roxb. in treating hypertension based on proteomics and bioinformatics

译名：基于蛋白质组学和生物信息学的土茯苓治疗高血压的分子机制研究

期刊：Frontiers in Pharmacology(中科院2区)

IF：4.4

发表时间：2024.5

通讯作者：钱海兵

通讯作者单位：贵州中医药大学

实验设计

结果

1. SGR对高血压大鼠血压的影响

在本研究中，每只SD大鼠腹膜内注射40mg/kg L-NAME进行建模，并且90%的大鼠在4w后出现高血压（收缩压≥130mmHg），表明该模型可靠。建模后，模型组（L-NAME）的收缩压和舒张压水平显著升高（p<0.05）。SGR-H、SGR-M、SGR-L和阳性药（卡托普利）治疗4周可有效降低L-NAME高血压水平（图1）。SGR-H、SGR-M、SGR-L和卡托普利阳性药组大鼠的收缩压和舒张压与模型组相比显著降低（p<0.05或p<0.01）。实验数据如补充表SA3所示。

图1 血压变化（1 mmHg=0.133 kPa）。与正常对照组相比，*p＜0.05和**p＜0.01；与模型组（L-NAME）比较，#p＜0.05和#p＜0.01。

2.土茯苓对高血压大鼠血脂指标的检测

与正常对照组（图2）相比，模型组TC、TG和LDL-C水平显著升高（p<0.05或p<0.01），HDL-C水平明显下降（p<0.05）；与模型组（L-NAME）相比，卡托普利组、SGR-H组和SGR-M组的TC、TG和LDL-C水平分别显著降低，HDL-C水平显著升高（p<0.05或p<0.01）。实验数据如补充表SA4所示。

图2 血清脂质指数的检测。数据显示为平均值±标准差。与正常对照组相比，*p＜0.05和**p＜0.05。与模型组（L-NAME）比较，#p＜0.05和##p＜0.01。

3.肝脏和肾脏的组织病理学分析

3.1肝脏组织病理学分析

在20倍、40倍和100倍物镜下，肝脏组织病理学染色显示，空白对照组肝细胞结构完整，形态规则，细胞间隙正常，大部分细胞核染色较深，核仁清晰，无变性坏死（图3A）。相反，模型组的肝细胞染色明显较轻，结构紊乱，核固缩（图3B）。与模型组（L-NAME）相比，阳性药物（卡托普利，图3C）、SGR-H（图3D）和SGR-M（图3E）组的上述参数有所改善。然而，SGR-L组（图3F）没有显示出显著的改善。

图3 大鼠肝脏病理学。（A）对照。（B）模型组（L-NAME）。（C）卡托普利（D）SGR-H。（E）SGR-M。（F）SGR-L。

3.2肾脏的组织病理学分析

在20、40和100倍物镜下，肾脏组织病理学染色显示，空白对照组大鼠肾小球结构完整，球囊比例正常。此外，肾小管紧密堆积，无炎症细胞浸润（图4A）。与空白对照组相比，模型组（L-NAME）肾小球较小，囊腔增大，肾小管紊乱，管腔狭窄（图4B）。与模型组（L-NAME）相比，阳性药物（卡托普利，图4C）、SGR-H（图4D）和SGR-M（图4E）组的上述参数有所改善。然而，SGR-L组（图4F）没有显示出显著的改善。

4.质谱质量控制分析

在质谱分析中，少于5个氨基酸的肽段产生的片段离子很小，序列鉴定不能有效。如果肽段大于20 个氨基酸，则质量和电荷数较高，并且不适合于高能诱导的片段化。本研究中鉴定的所有肽都在7–20个氨基酸的范围内。它们符合胰蛋白酶水解和高能诱导的切割断裂的一般规则（补充图S1）。补充图S2显示了蛋白质的分子量和所鉴定的覆盖率之间的关系；蛋白质的分子量与覆盖率呈负相关。

图5 DEP识别结果。（A）与对照组相比，模型组中的基因表达存在差异。（B）与模型组（L-NAME）相比，SGR的差异表达基因。（C） 模型组92种不同的蛋白质和SGR。

5.差异表达蛋白的鉴定

根据蛋白质丰度水平的差异，通过t检验评估实验组和对照组之间差异的显著性。不同组之间的DEP根据倍数变化>1.2或<0.85和p<0.05进行鉴定。DEP具有两个或多个特异性肽片段。与正常对照组相比，模型组中鉴定出175个DEP（图5A）。与模型组相比，SGR处理后发现220个DEP（图5B）。模型组和SGR组共发现92个DEP（图5C）。补充表SA5中给出了92个DEP。

6.差异表达基因的GO和KEGG通路富集分析

我们对DEPs进行了GO和KEGG富集分析。DEPs的GO注释由三个部分组成，即BP（生物过程）、MF（分子功能）和CC（细胞成分），用于分析DEPs的功能富集。BP术语显示，DEP在“小分子分解代谢过程”、“有机酸分解代谢过程和”羧酸分解代谢过程“中富集（图6A）。MF术语显示DEP富含“单加氧酶活性”（图6B）。就CC而言，术语“过氧化物酶体”、“微体”、膜微结构域和“过氧化物体基质”显著富集（图6C）。进行KEGG分析以确定DEP与信号通路之间的关系。总共有92个DEP主要参与“药物代谢-细胞色素P450”、“过氧化物酶体”、“β-丙氨酸代谢”、“脂肪酸降解”和“丙酮酸代谢信号通路”（图6D）。GO和KEGG富集结果分析如补充表SA6所示。

7. Hub基因鉴定

使用“CytoHubba”中的四种算法（degree、EPC、stress和closeness）来计算每个基因的总重量。图7A显示了EPC输出的hub基因。图7B显示了应激产生的中枢基因输出。图7C显示了按紧密度划分的hub基因输出，图7D显示了按程度划分的hub蛋白基因输出。最后，获得了四个hub基因（ALDH2、CYP4A11、MSMO1和GSTM4）（图7E）。

8.ALDH2与免疫细胞浸润的关系

我们使用ssGSEA算法进行分析。CYP4A11和GSTM4对免疫细胞几乎没有影响（补充图S3），在GEO数据集中没有发现MSMO1。免疫细胞与ALDH2具有高度相关性。研究发现，ALDH2基因与各种免疫细胞有关（图8）。ALDH2与调节性T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、髓源性抑制细胞、γ-ΔT细胞等呈正相关（p＜0.001）；ALDH2与活化的CD8 T细胞、中央记忆性CD4 T细胞和中央记忆性CD8 T淋巴细胞等呈负相关（p＜0.001）。CYP4A11、MSMO1和GSTM4与免疫细胞浸润没有显著关系，也不会被关注。

9.ALDH2在血清和肝脏样本中的表达

从肝组织中提取蛋白质，并对每组样品进行三次生物重复。通过酶联免疫吸附测定法检测肝脏和血清样品中的ALDH2水平（图9）。与正常对照组相比，模型组（L-NAME）肝脏和血清样品中ALDH2的含量显著降低（p<0.01），在阳性药物、高剂量和中剂量SGR干预给药后，ALDH2含量显著增加（p<0.05或p<0.01）。

10. 基于UHPLC-MS/MS的土茯苓化合物的分析

对水提取物进行UHPLC–MS/MS分析，以表征SGR的化合物。总离子色谱图以正离子（图10A）和负离子（图10B）模式显示。通过保留时间、MS/MS片段和参考文献中报道的数据进行初步比较分析后，我们发现在SGR中发现了18种化合物（表1）。图10C显示了正离子模式和负离子模式是一致的。

表1 土茯苓的化合物鉴定

图10 应用 UHPLC-MS/MS技术鉴定土茯苓水提液中的化合物。（A）SGR样品的正离子模式下的总离子色谱，如图所示。（B）SGR样品的负离子模式下的总离子色谱，如图所示。（C）正离子模式和负离子模式是一致的。

11. 配体和受体优化

配体优化是基于SYBYL对SGR活性成分进行优化。图11A是未优化的活性成分棒模型（棒），共有18个配体。红色代表氢原子，蓝色代表氧原子。基于小分子配体的Tripos力场进行了能量最小化计算，优化了分子结构，得到了合理的构象（图11B）。每个小分子都被放置在受体蛋白的配体结合位点。优化配体的配置和位置，使其与受体具有最佳结合效果，并对最佳结合构象进行评分。根据评分对所有化合物进行分类，并对18个配体进行结构修饰，以提高配体和受体之间的亲和力。

ALDH2结构从PDB数据库下载（图11C）。分辨率为2.40Å。蛋白质链以图形表示，配体以棒的形式显示，口袋以球体的形式显示。蛋白质由深绿色和棕色条带表示，配体由棒表示。选择配体（A/Q6ZE606）模式，通过SYBYL脱水、添加全氢和电子来形成口袋。在这种分子对接计算中，通常是有机小分子的结合位置。对于蛋白质-小分子复合物的X射线晶体结构，口袋中有一个配体，绿色区域是对接口袋的位置，即受体中的配体结合区域（图11D）。

表2 分子对接分析

12. 分子对接分析

通过iGEMDOCK和SYBYL 2.1.1分析SGR和ALDH2的组合（表2）。通过SYBYL 2.1.1，发现有8个化合物与ALDH2结合良好（T_Score＞5）。通过iGEMDOCK，发现11种化合物与ALDH2具有良好的组合（能量<−100 Kcal/Mol）。这两个软件应用程序共同发现，八种化合物与ALDH2具有良好的组合。八种化合物的结合口袋如图12A–H所示。

表3 与ALDH2相互作用的主要活性成分

图12 八种化合物与ALDH2对接口袋。 （ A） 西阿尼醇 。（B） 紫杉叶素 7-鼠李糖苷。（C） 根皮素 。（D） 柚皮苷 。（E） 橙皮素 。（F） 柚皮素 。（G） 雌三醇 。（H）Neobavaisoflavone。

高血压是指一种临床综合征，其特征是身体循环动脉血压（收缩压 /舒张压）升高，并伴有心脏、大脑、肾脏和其他器官的功能性或器质性损伤。 病理学研究发现，高血压大鼠肝脏染色浅，结构紊乱，核实变，水肿明显，脂肪变性。同时，肾小球收缩变小，囊腔扩张，肾小管排列紊乱，管腔变窄。高血压大鼠血压显著升高， TC、TG和LDL-C水平也显著升高，HDL-C水平显著下降，表明模型（L-NAME）成功复制。LDL-C和TC水平的长期升高会损害血管内皮细胞及其功能，导致内皮因子（ET-1/NO）失衡，血压持续升高，并增加高血压发生和发展的风险。 先前的另一项研究表明， TG是高血压的重要危险因素，控制TG水平可以降低高血压的发病率。 本研究发现， SGR干预4周可有效降低高血压大鼠的收缩压和舒张压，显著降低TC、TG和LDL-C水平，提高HDL-C水平。

本研究使用蛋白质组学和生物信息学来筛选与特异性免疫细胞浸润相关的关键高血压靶点。结果表明， SGR干预高血压的92个靶点涉及5个信号通路。 先前的一些研究报道了脂肪酸降解、β -丙氨酸代谢、代谢信号通路和心血管疾病之间的相关性。 醋酸盐可以通过调节中枢神经系统功能、减少胆固醇合成和增加脂肪酸氧化来降低患心血管疾病的风险。醋酸盐能有效降低血压，改善心脏功能，纠正脂质代谢紊乱；从而影响心血管疾病的预防和治疗。过氧化物酶体增殖物激活受体（ PPAR）是一个核受体超家族。PPARα主要与脂质代谢有关。PPARγ具有多种病理生理作用，主要涉及脂肪细胞的分化。 脂肪酸代谢异常对血流动力学的影响引起了人们的关注，先前几项研究的结果表明，高血压和血脂异常有着共同的遗传和环境基础。本研究结果表明， SGR治疗高血压可能与β-丙氨酸代谢、脂肪酸代谢和丙酮酸代谢等途径有关。

蛋白质相互作用分析显示乙醛脱氢酶 2（ALDH2）是 关键 靶标。ALDH2是一种线粒体特异性酶，也是体内最重要的保护因子之一。 广泛分布于肝脏、心脏和大脑组织中。其作用是防止乙醛对细胞膜的脂质过氧化，抑制细胞凋亡。 ALDH2可通过代谢4-HNE发挥抗氧化作用，从而抑制高血压的发生和发展。 先前的研究报告称， ALDH2缺乏会增加体内的氧化应激，是高血压的易感因素。 先前的一些研究也发现， tALDH2在心血管和神经系统、肿瘤和其他疾病中发挥着重要作用，是预防和干预心血管疾病的重要靶点。 免疫细胞浸润表明 ALDH2基因与各种免疫细胞相关。 突变型 ALDH2通过影响巨噬细胞的自噬能力和脂质代谢来增强泡沫细胞的形成。 骨髓源性抑制细胞（ MDSC）、调节性T细胞、中性粒细胞和其他细胞在心血管疾病中发挥着重要作用。 调节性 T细胞也称为抑制性T细胞，是具有调节功能的T细胞亚群，包括免疫抑制功能、维持自我耐受和避免免疫反应损伤。 它们在各种免疫疾病中起着重要的调节作用。 MDSC是一种抗炎免疫细胞，其特征在于CD11b和Gr-1的表达。 它通过过氧化氢抑制 T细胞活性，从而减少脾脏和肾脏炎症细胞的数量和促炎表型，进一步调节免疫系统和高血压。 然而，关于 ALDH2与这些免疫细胞之间的相关性的报道相对较少。 这项研究发现 SGR影响ALDH2的表达，并通过筛选表明ALDH2表达与免疫细胞相关。 然而， SGR是否影响ALDH2的表达，并进一步影响免疫细胞的表达，还需要进一步研究。

SGR具有药用和食用价值。UHPLC-MS/MS检测到SGR的18个组分，其中8个化合物通过UHPLC-MS/MS和SYBYL 2.1.1与ALDH2结合良好。 传统应用 SGR可以治疗各种疾病（如炎症、布鲁氏菌病、梅毒、急慢性肾炎），也可以作为免疫调节剂和肝脏保护剂。 进一步的分子对接表明，六种化合物（西阿尼醇 、根皮素、橙皮素、柚皮素、 柚皮苷 和 紫杉叶素 7-鼠李糖苷）可能是高血压保护因子的潜在干预治疗药物。 由于这两种化合物（ neobavaisoflavone 和 esterol）迄今尚未得到深入研究，值得进一步深入研究。 动物实验表明，西阿尼醇 可以降低血压，保护内皮细胞，减少氧化应激反应，缓解炎症，改善血脂分布；根皮素具有抗炎、抗氧化和降压作用； 橙皮素是一种二氢黄酮类化合物，具有抗氧化、抗癌、降脂等多种生物活性；柚皮素具有多种药理特性。纳林宁可以改善肥胖、糖尿病和高血压； neobavaisoflavone 具有抗炎、抗癌和抗氧化作用。然而， neobavaisoflavone 对血压的影响尚未被探索，需要进一步研究。柚皮苷是一种黄烷酮糖苷，具有抗氧化、降脂、抗癌和抑制细胞色素 P450酶的药理作用。 先前的研究报告称，长期增加黄酮类化合物的摄入量可以有效降低人群中心血管疾病的发病率。活性成分筛选表明， SGR中黄酮类化合物可能是降压的关键物质基础。 因此，本研究进一步从 SGR中开发出治疗高血压的活性成分，为治疗高血压提供靶向抑制剂 。

原文链 接： https://doi.org/10.3389/fphar.2024.1360829

中医药基础科研服务：

相关咨询，加微信：1278317307。

【福利时刻】科研服务（点击查看）：、、、、、。咨询加微信：1278317307。