Cell｜樊荣团队开发全球首个临床级FFPE样本空间全转录组测序技术

空间转录组学技术能够在生物组织原位绘制复杂的基因表达图谱，正在革新我们对发育生物学、免疫学、肿瘤学以及疾病病理学的理解【1】。然而，迄今为止，该领域的研究范围主要集中在信使RNA（mRNA）表达的分析上。真核细胞的转录组由动态多样的RNA分子组成，不仅包括编码蛋白合成的成熟mRNA，还涵盖剪接变体、小RNA及其他具有调控功能的非编码RNA。因此，对不同RNA物种在其生命周期中的空间定位进行分析，对于全面解剖复杂组织中的RNA生物学至关重要。

此外，在临床实践中，福尔马林固定石蜡包埋（Formalin-fixed Paraffin-embedded，FFPE） 组织是病理学诊断的基石。全世界的临床病理科积累了大量FFPE组织块，这些材料与详细的临床数据相结合，构成了尚未充分利用的人体生物学和转化研究的宝贵资源。然而，FFPE样本也带来了特定挑战。在石蜡包埋过程中，样本中的RNA高度片段化，并且在室温储存条件下进一步降解。因此，对临床级FFPE样本中的RNA分子进行空间分析极为困难。

2024年9月30日，耶鲁大学樊荣团队的白志亮博士等在Cell杂志上发表了题为Spatially exploring RNA biology in archival formalin-fixed paraffin-embedded tissues的论文，报道了全球首个临床级FFPE样本空间全转录组测序技术——Patho-DBiT。该平台巧妙地利用FFPE样本中自然发生的RNA片段化，向广泛多样的RNA分子原位添加poly(A)尾，结合微流控条形码标记和算法创新，成功实现了对临床存档FFPE组织的全覆盖、逐碱基的空间全转录组测序。Patho-DBiT通过对完整mRNA、缺失poly(A)尾的片段化mRNA、各类大/小非编码RNA、剪接异构体以及携带单核苷酸变异 （SNV） 的前体RNA进行空间条形码标记，精确解码了FFPE复杂组织中丰富的RNA生物学信息，包括单细胞级mRNA图谱、非编码RNA表达、可变剪接、遗传变异、microRNA调控及RNA动态变化等 （图1） 。

图1. Patho-DBiT技术流程及全场景空间分析能力。

研究团队在不同组织类型和空间分辨率下对Patho-DBiT进行了充分验证。在小鼠脑冠状切片的分析中，Patho-DBiT在50微米的空间像素中平均检测到6786个基因和31063个独特分子标记 （UMI） 。聚类分析精确重构了大脑组织的解剖结构，其空间排列与Allen小鼠大脑图谱上相似切片的区域注释高度一致。此外，Patho-DBiT捕获了调控大脑重要功能的基因及其区域性剪接异构体的表达，其空间分布与一套独立的、通过长读长纳米孔测序获得的新鲜冷冻脑样本数据相吻合。在对室温下存放超过5年的T细胞淋巴瘤样本的分析中，Patho-DBiT精准揭示了淋巴瘤发生的基础生物学机制。其转录组捕获的准确性通过在相邻组织切片上使用CODEX技术进行的高重度免疫荧光空间细胞分型分析得到了验证。

团队接下来使用了100×100的微流控设备，以20微米的像素尺寸对10,000个点进行条形码标记，空间解析了被诊断为黏膜相关淋巴组织边缘区淋巴瘤（MALT）的临床肿瘤活检样本。该组织已在室温下存放超过三年。Patho-DbiT通过一次试验即获得了该样品的多重信息。首先，对基因表达矩阵的无监督聚类分析识别出20个亚群，这些亚群在空间上与组织学结构高度一致。即便是数量较少的特定区域细胞类型，Patho-DBiT也能精准检测，并通过免疫荧光染色验证了其可靠性。研究人员进一步使用最新开发的计算平台iStar【2】将分层组织学图像特征提取与转录组学数据相融合，成功实现了单细胞水平的空间基因表达映射，大幅提升了空间细胞异质性的解析能力（图2）。其次，Patho-DBiT能够捕获全基因组范围内的序列变异，并生成空间SNV表达矩阵。它无需依赖已知标记物，通过无监督聚类即可区分肿瘤亚克隆与非恶性细胞，并预测克隆进化关系。此外，该MALT组织的测序数据中有35%的序列映射到了非编码RNA，Patho-DBiT捕捉到了从数十到数千种不同非编码RNA分子的空间分布及其与肿瘤发生的关系。研究人员专门对microRNA进行了深入分析，因为它们在包括癌症在内的多种病理中起到重要调控作用。在约2300种已知的人类成熟microRNA中，Patho-DBiT在MALT切片中检测到了1352种microRNA，其映射序列的长度峰值为21个核苷酸，与此类小RNA的已知长度完全一致。通过对肿瘤区域和非肿瘤区域的microRNA进行差异表达分析，研究人员在空间上绘制了microRNA在肿瘤发生中的调控网络。

图2. 通过iStar增强的MALT样本高分辨率空间组织结构。

最后，研究团队使用10微米像素分辨率的微流控设备对弥漫性大B细胞淋巴瘤 （DLBCL） 切片进行了单细胞水平的空间分析。值得注意的是，该切片与MALT样本同时从同一位患者的胃部不同区域采集而来。相比低度恶性的MALT淋巴瘤，DLBCL具有更高的恶性和侵袭性。通过Patho-DBiT技术，研究人员得以在细胞水平上精确绘制从低级别肿瘤向高级别肿瘤演化的分子图谱，深入揭示了转化性大B细胞淋巴瘤中肿瘤微环境复杂的相互作用机制。

耶鲁大学生物医学工程系樊荣教授指出：“这是我们第一次能够直接‘看到’各种RNA分子种类，了解它们在临床FFPE组织切片中的位置以及它们的功能。使用这一工具，我们可以更好地理解每种RNA分子复杂而有趣的生命周期，而不仅仅是知道每个基因是否表达。我认为这将彻底改变我们未来研究人类生物学的方式。”

耶鲁大学血液病理科主任、资深病理学家Mina Xu（徐路青） 教授对这项技术的使用充满热情: “作为一名长期从事癌症诊断的医生，我对Patho-DBiT所能看到的细节感到非常惊讶。我认为，这种深入的分子分析将会极大推动我们对肿瘤生物学的理解。”

耶鲁大学遗传系卢俊教授提到：“ 非编码RNA是生物医学研究的前沿领域，然而现有的空间组学技术在捕获非编码RNA方面存在局限。许多非编码RNA，如microRNA和tRNA等，在生物体内发挥着至关重要的作用。Patho-DBiT 提供了一个优异的解决方案，不仅能够绘制组织样本中蛋白编码RNA的二维表达图谱，还能同时捕获对应的非编码RNA表达图谱。该技术为探索非编码RNA在生命过程中的作用及研究包括癌症在内的疾病注入了全新动力。 ”

费城儿童医院计算和基因组医学中心主任邢毅教授表示：“ 我非常高兴能够参与这项工作，并探索Patho-DBIT技术对于生物医学研究的巨大潜力。我们的分析表明Patho-DBIT能够对FFPE组织进行RNA可变剪接和A-to-I编辑的空间分析。该技术为揭示各种生理和病理条件下转录后RNA调控的空间复杂性提供了崭新的机会。 ”

宾夕法尼亚大学生物统计和流行病系教授、单细胞与空间基因组学统计中心主任李明瑶教授表示：“ 我很荣幸能够参与这项激动人心的研究，该技术使我们能够在同一FFPE样本切片中研究所有RNA分子种类。我也很高兴看到iStar能够进一步提升这一突破性技术的空间分辨率至单细胞水平，使我们能够以前所未有的空间精度探索RNA生物学。 ”

以上教授共同领导了这项技术的开发。白志亮博士、张丁垚、高岩博士、陶波博士、张岱为博士和包硕桢为论文的共同第一作者。

总之，Patho-DBiT能够在临床级FFPE组织中同时进行多种RNA种类和过程的空间分析，具有高灵敏度和广泛覆盖度。此外，它还能进行全基因组范围的SNV定位，并在单细胞水平上解析肿瘤发生的时空过程。评审专家对这项技术给予了高度评价，称其为“罕见的能够表征多种RNA类别空间表达的技术”，并认为这是“对空间组学领域的重要且及时的贡献”，将“极大拓展我们对临床样本生物学的理解”。

https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.09.001

参考文献

[1] Bressan D, Battistoni G, Hannon G J. The dawn of spatial omics [J]. Science, 2023, 381(6657): eabq4964.

[2] Zhang D, Schroeder A, Yan H, et al. Inferring super-resolution tissue architecture by integrating spatial transcriptomics with histology [J]. Nature Biotechnology, 2024,

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