上海
核酸药物，涵盖了各种形式的DNA或RNA，已成为继小分子药物和抗体药物之后的第三大药物类别。早期典型的核酸药物，如小干扰RNA（siRNA）、微小RNA （miRNA） 和反义寡核苷酸 （ASO） ，通过与靶RNA配对，实现了对靶基因的抑制。由于这些核酸药物长度较短，化学合成方法能够高效且高质量地合成它们，以满足治疗需求。
然而，随着核酸药物的不断发展，CRISPR/Cas系统作为一种新型核酸药物展示了巨大的潜力。但值得注意的是，该系统所需的sgRNA长度约为100-150核苷酸 （nt） ，远超早期典型的核酸药物 （<40 nt） ，且基于CRISPR/Cas系统开发出的招募系统，更是进一步增加了sgRNA的长度需求, 特别是新一代基因编辑技术——先导编辑 （Prime Editing, PE） 中的核心组件pegRNA，其序列长度较长 （至少约125-145 nt） ，而引入evopreQ1基序的epegRNA，长度更大于170 nt。然而，传统化学合成RNA的长度通常受限于约100 nt，随着序列长度的增加，整体合成效率和质量显著下降，这无疑为这些工具作为核酸药物的研发带来了严峻挑战。
2024年9月30日，武汉大学医学研究院，免疫和代谢前沿科学中心、泰康生命医学中心、武汉大学中南医院的殷昊研究团队在Nature Biotechnology在线发表题为Rapid generation of long, chemically modified pegRNAs for prime editing的研究文章。该研究运用RNA连接技术，成功突破了化学合成RNA的长度壁垒，高效地制备出了高纯度的化学修饰pegRNA和epegRNA（分别称为L-pegRNA和L-epegRNA） 。这种方法制备的L-epegRNA在多种细胞系及两种原代细胞中均展现出了卓越的编辑效率。
研究团队首先以sgRNA为模型，采用RNA连接方法，验证了T4 Rnl2酶在RNA连接中的可行性和高效性。为了进一步提升连接效率，研究团队开展了一系列优化实验，从连接温度、夹板DNA长度、连接比例及酶量等多个维度对RNA连接体系进行了全面的优化，这些优化措施提升了RNA的连接效率。并且通过这种方法连接产生的RNA成功的诱导了基因编辑。
为了更有效地保护pegRNA的3’端，研究团队设计了三种不同的连接策略，并最终发现当evopreQ1基序与化学修饰联合使用时，能够展现出更为出色的性能，实现最高的先导编辑效率。此外，为了去除连接中存在的副产物，研究团队还引入了高效液相色谱 （HPLC） 技术，该技术能够精准且高效地将目标pegRNA从反应混合物中分离纯化至较高纯度。HPLC纯化的L-epegRNA进一步提升了编辑效率。值得注意的是，即便未经HPLC纯化的L-epegRNA也展现出了令人满意的编辑效率。这意味着，不具备HPLC纯化实验条件的情况下也能制备诱导高效先导编辑的L-epegRNA。
研究团队还对RNP递送系统进行了系统性优化，并比较优化后的RNP与质粒递送在多种细胞中的表现。结果显示，在多数对比实验中，L-epegRNA介导的RNP递送均展现出了比质粒递送更高的编辑效率。
作为另一种广泛应用于治疗与科研领域的策略，RNA递送也备受关注。研究团队利用电穿孔转染技术，成功实现了PEmax mRNA与L-epegRNA的共递送，并在多种细胞系中实现了高效的编辑。同时，研究团队还在两种原代细胞中测试了L-epegRNA，并展现出了出色的编辑能力。相较于体外转录的epegRNA, L-epegRNA将先导编辑效率最高提升了数百倍。这预示着其在临床应用、精准医疗及遗传病治疗等领域具有巨大的应用潜力。
最后，研究团队还探究了该方法在生成更长RNA方面的能力，通过连接成功制备了210个核苷酸以及234个核苷酸的L-epegRNA，并分别利用RNP和RNA递送系统实现了高效的长片段插入。
综上所述，该团队所开发的方法不仅成功实现了长链、高质量化学修饰RNA的高效制备，而且在以pegRNA为模型的测试实验中得到了充分的验证。展望未来，这一方法有望被广泛应用于其他因合成长度受限而难以制备的核酸药物的研发中。
武汉大学殷昊教授为该研究的独立通讯作者，研究生雷薪霖（博）、黄安慧（硕）、陈迪迪（硕）和王雪镔（博）为共同第一作者。武汉大学殷昊课题组长期专注于基因编辑和核酸药物，取得了系列原创性成果。
https://www.nature.com/articles/s41587-024-02394-x
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