1区-成中医大揭示芍药苷通过MAPK/mTOR通路激活自噬，保护APAP诱导的肝细胞损伤

药物性肝损伤（DILI）逐渐成为全球普遍存在的导致急性肝功能衰竭的问题，尤其是对乙酰氨基酚（APAP）引起的急性肝损伤。

2024年9月7日，成都中医药大学药学院马骁教授团队在Cell Mol Biol Lett在线发表了题为“Paeoniflorin protects hepatocytes from APAP-induced damage through launching autophagy via the MAPK/mTOR signaling pathway”的文章。揭示芍药苷通过激活自噬，通过MAPK/mTOR信号通路抑制氧化应激和细胞凋亡，从而减轻肝损伤。

摘要

PF 可降低 APAP 小鼠血清中的 ALP、γ-GT、AST、TBIL 和 ALT 水平，并显著减轻肝组织炎症和水肿。同时，TUNEL 染色结果和相关凋亡因子与转录组学结果相一致，表明 PF 通过调控 MAPK 信号抑制肝细胞凋亡。此外，PF 还作用于活性氧 (ROS)，调节氧化应激，修复受损的线粒体。更重要的是，透射电子显微镜显示 PF 处理后自噬小体的生成，PF 还下调了 mTOR 并上调了ATG5、ATG7和BECN1等自噬标志物的表达在mRNA水平上，在蛋白质水平上，对LC3、p62、ATG5、ATG7进行了检测，提示PF发挥作用的过程伴随着自噬的发生。此外，结合MAPK的分子动力学模拟和Western印迹，结果提示p38是PF对APAP的直接作用靶点。具体来说，PF通过下调MAPK/mTOR信号来激活自噬，从而减轻APAP损伤。芍药苷通过激活自噬来抑制氧化应激和细胞凋亡，从而减轻肝损伤，该过程通过MAPK/mTOR信号通路实现。总之，我们的研究结果阐明了芍药苷在DILI中的作用和机制，有望为芍药苷的开发提供新的治疗策略。

1.PF 可减轻 APAP 引起的肝损伤病理变化

病理检查发现，注射APAP后，APAP组小鼠开始出现体重下降，而注射APAP后第5天各组小鼠的生理变化相似（图 1 C）。此外，还测量了小鼠的肝脏指数和脾脏指数，结果显示APAP组的肝脏指数和脾脏指数均增加（p < 0.01）。而HPF和LPF组小鼠的肝脏指数和脾脏指数均降低（p < 0.01），说明PF减轻了小鼠脾脏和肝脏的肿胀（图 1 A，B）。

当肝细胞受到中毒、感染、坏死、炎症等损伤时，作为肝损伤的敏感指标，血清转氨酶就会释放入血，即ALT、AST、TBIL。进一步测定了肝功能特有的指标，与对照组相比，APAP组血清上述指标水平明显升高，提示DILI模型成功建立。而PF高、中剂量组ALT、ALP、γ-GT、TBIL、AST水平明显低于 APAP组（图1 D-H）。除TBIL，LPF组（50 mg/kg）对其他指标敏感，并有效降低其含量（图 1 G）。

与生化指标类似，病理结果显示APAP组肝小叶排列紊乱，大量坏死肝细胞分布于门管区周围，并浸润有炎性因子，视野内可见大面积灶性坏死（×100）。与APAP组相比，MPF和HPF组肝小叶结构清晰，排列紧密，PF组肝组织水肿及炎性浸润得到改善，以高剂量组为佳（图 1 J）。此外，计算肝组织坏死指数。PF治疗后肝损伤减轻（图 1I)。总之，PF对肝脏具有保护作用，明显减缓了APAP引起的肝损伤的进一步进展。

图1PF 对 APAP 诱导小鼠的生化和病理参数变化

2.PF抑制ROS提高APAP模型小鼠抗氧化能力

参与氧化应激反应的一些关键信号分子是ROS和抗氧化剂化合物。在APAP诱导的肝损伤中，ROS的过度积累会破坏细胞稳态，进一步引发氧化应激和线粒体功能障碍。为了阐明PF治疗对氧化状态的影响，首先评估了氧化相关指标的水平，例如GSH，SOD和MDA。与对照组相比，用APAP处理的SOD和GSH含量显著降低，而不同浓度的PF可恢复APAP小鼠的抗氧化能力，尤其是在200mg / kg时（图 2A、B）。与 GSH 和 SOD 的作用相反，MDA 水平的变化是机体氧化能力的反应。对于 MDA，不同剂量的 PF 可减轻 APAP 组中出现的明显增加和氧化作用的发生（图 2C）。这些指标表明 PF 可缓解 APAP 模型中氧化应激的发生。同时观察并测定ROS的表达情况，采用免疫荧光法检测（图 2E）。ROS的免疫荧光显示，MPF和HPF组的ROS荧光表达明显低于APAP组，提示PF高、中剂量组显著抑制肝细胞ROS的表达（p <0.01）（图 2D）。此外，APAP在细胞色素P450酶CYP2E1和CYP3A4的代谢产物NAPQI在积累过程中诱导大量细胞死亡和线粒体功能障碍，进而导致损伤，这意味着在APAP过量损伤过程中可以看到细胞色素P450酶表达增加。实验也观察到了类似的结果。IHC显示APAP组CYP2E1的阳性表达水平高于对照组和PF组（图2 I）。相比之下，APAP组CYP2E1的反应以加剧为主。然而，与APAP组 相比，给予100和200 mg / kg剂量的PF明显逆转了APAP刺激的氧化应激（图 2 H）。同时，通过蛋白质印迹检测到CYP3A4的表达。注射APAP后CYP3A4的表达增加，而200 mg / kg剂量的PF显著逆转了这种影响（图 2G）透射电镜观察发现APAP组线粒体结构模糊，脊线不清，基质电子密度增加，粗面内质网扩张。高剂量PF处理后，线粒体结构完整，基质均匀，在电镜下呈现均匀的灰色结构，粗面内质网形态结构恢复（图2J ）。这说明PF能抑制ROS的生成，提高细胞色素P450酶活性，增强小鼠对抗APAP损伤的抗氧化能力。

图2 PF 对 APAP 刺激下氧化应激的影响

3.PF 抑制 APAP 诱导的肝损伤中细胞凋亡的进展

随着ROS积累引起线粒体外膜通透性改变，Bcl-2蛋白家族释放促/抗凋亡因子调控细胞凋亡过程，进而激活caspase 9，进一步释放caspase 3，引发细胞凋亡。TUNEL染色可以直观地反映细胞凋亡的发生情况，如图 3A所示。与对照组相比，APAP组肝损伤区域聚集了大量的凋亡阳性因子。与APAP组相比，治疗组凋亡阳性表达率明显降低，提示PF可以改善APAP诱导的肝损伤中细胞凋亡的发生（图 3D）为进一步证实PF治疗肝损伤中凋亡的作用，采用IHC检测凋亡特征因子的阳性表达。阳性表达集中于肝门管区，APAP刺激的小鼠肝脏中caspase 3表达更重，提示肝损伤过程伴随有细胞凋亡。caspase 9表达在对照组中呈低水平，在APAP组呈高表达。PF预处理可减弱促凋亡蛋白（caspase 9和caspase 3）的阳性表达，在200mg/kg剂量下效果最佳（图3B 、 C）。

用Western印迹法检测促/抗凋亡蛋白（BAD、BAX、caspase 9、caspase 3、BCL-2）的相对表达（图 3E、F）。BAD、BAX、caspase 9的相对蛋白表达相似，均显示APAP处理后其表达升高，而PF处理后其相对表达明显降低（图 3G、I、K）。caspase 3是凋亡最敏感的指标，不同剂量的PF均能有效抑制APAP引起的表达升高（图 3L)。虽然BCL-2的结果在对照组和APAP组之间没有差异，但 与对照组相比， APAP组的BCL-2/BAX比值明显下降，而在HPF组则明显升高(图 3H、J)。这一结果表明PF通过促进抗凋亡蛋白的活性，终止促凋亡蛋白的表达，发挥抗凋亡作用。

图3 PF 在 APAP 诱导的肝损伤中的抗凋亡作用

4.PF 激活自噬保护肝脏免受 APAP 损伤

相关研究认为，自噬选择性地清除受损的线粒体和NAPQI-蛋白质加合物，从而阻断APAP引起的肝损伤进展。利用透射电镜观察肝组织中自噬体的数量和细胞器的结构（图 4A）与其他组相比，APAP组肝细胞内粗面内质网广泛肿胀，仅见少量自噬体，同时可见肝细胞凋亡、核皱缩、染色质浓缩等现象。相对而言，PF组肝细胞自噬体数量明显增加，肝细胞形态结构完整，染色质分布均匀。LC3作为自噬过程的下游表现分子，代表自噬从I型向II型的转变，标志着自噬的开始。此外，p62作为自噬的枢轴，与自噬及线粒体自噬的调控密切相关。因此，采用IHC和WB观察自噬调控相关蛋白（LC3和p62）的变化（图 4B、C）。IHC结果显示，PF可增加LC3的阳性表达，对自噬有促进作用（图 4D）。另一方面，APAP组p62的表达显著增加，而PF处理可减轻这种表达（图 4E）。与IHC相似，WB结果显示MPF和HPF组p62的表达明显抑制。对于LC3，APAP可明显降低II型与I型的比例，而PF可有效减缓这一过程（图 4F、G）。

图4 PF 调控自噬代表指标的变化

免疫荧光结果显示，APAP组荧光较弱，MPF和HPF组荧光较强（图 5 A，C）。WB结果表明，与对照组相比，APAP组的ATG5和ATG7均被耗尽。相反，PF逆转了APAP的作用并促进了它们的表达（图 5 D，E）。还测量了mRNA表达水平以确定APAP诱导的小鼠的自噬活性变化。APAP组的ATG5，ATG7和BECN1水平降低与对照组相比。这些结果表明，PF 有效缓解了 APAP 产生的自噬抑制。

图5 PF在 APAP 诱导小鼠中激活自噬

5. 转录组学揭示 PF 对 APAP 诱发肝损伤的深层机制

目前研究结果表明，PF 改善 APAP 诱导的 DILI 与激活自噬、抑制氧化应激和细胞凋亡密切相关，但 PF 调控这些表型作用的机制尚不清楚。因此，对小鼠肝脏样本进行了测序，以进一步了解 PF 对抗 APAP 所致肝损伤的潜在机制。与对照组不同，APAP组有2444个基因上调，1552个基因下调。HPF组和APAP组之间共有508个不同的基因，其中443个基因下调，65个基因上调（图 6A、B）。基因集富集分析（GSEA）显示，PF对MAPK信号通路、mTOR信号通路、细胞凋亡、谷胱甘肽代谢等多个信号和生理过程发挥调控作用。此外，结合GO分析和KEGG富集的结果，MAPK通路得分较高，在三组差异基因分析中表现同步（图 6C–F）。因此，转录组学分析结果提示，MAPK信号通路在PF对抗APAP药物性肝损伤的活性中起着关键作用，进而调控mTOR信号，激活自噬，抑制氧化应激和细胞凋亡。

图6 PF 在改善 APAP 诱导的肝损伤中的转录组分析

6. PF 通过直接靶向 p38 阻断 MAPK/mTOR 信号通路

根据转录组学结果，对 MAPK 信号在 DILI 发展和 PF 治疗中的重要性很感兴趣。为了进一步研究 PF 对 MAPK 信号传导的作用，进行了分子对接分析。p38-PF 复合物表现出很强的结合能力，结合能为 -32.50 ± 0.71 kJ/mol，而 ERK-PF 复合物的结合能为 -21.65 ± 0.98 kJ/mol，这表明p38 可能是 PF 的潜在靶点。PF 分别通过一个氢键与 MET265、LEU291 和 LEU246 残基结合，而 LYS295 通过两个氢键与 PF 连接。此外，GLY240 通过一个碳氢键与 PF 结合（图 7A）。随后，通过分子动力学模拟探究PF与p38的结合能力。均方根偏差（RMSD）结果显示，蛋白-配体复合物在20 ns后达到平衡，表明整个模拟稳定可靠（图 7 B）。溶剂可及表面积（SASA）和回转半径（Rg）均反映了模拟过程中复合物蛋白质结构的紧密程度，结果表明两个变量均呈下降趋势，表明蛋白质结构的紧密程度有所提高，p38-PF复合物结合良好（图 7 C，D）。p38-PF复合物的蛋白质均方根波动（RMSF）小于0.35 nm，表明蛋白质-配体结合稳定（图 7E）。此外，氢键分析表明p38与PF之间平均氢键数分布为0.51（图 7 F）。总结合自由能为−79.263kJ/mol，表明p38-PF复合物具有很好的稳定性，主要相互作用是由范德华力和静电能决定的。这些结果提示，在MAPK信号级联中，PF可能靶向p38而不是ERK，并且PF与p38之间的结合是稳定的。

图7 PF 靶向 p38

此外，mRNA表达结果与转录组分析结果一致。PF（200mg/kg）显著下调MAPK1、MAPK14和mTOR的相对表达（图 8A -C）。Western印迹结果显示，过量注射APAP后，p38和ERK蛋白的磷酸化被显著激活，而MPF和HPF能有效抑制这种变化（图 8E、F）。然而，对于mTOR的磷酸化，仅在200mg/kg PF浓度下才显示出抑制作用（图 8H）。这表明PF作用于MAPK信号，进而调节mTOR的磷酸化。此外，ULK1的磷酸化受APAP刺激抑制，而PF明显逆转了这种作用，恢复了ULK1的磷酸化，进一步激活了下游的自噬蛋白（图 8G，I）。简而言之，结果表明PF通过阻断MAPK / mTOR信号来启动自噬，从而保护肝细胞。

图8 PF对MAPK/mTOR信号通路的调节

结论

综上所述，本研究提示芍药苷抑制了 APAP 诱导的肝损伤的关键过程，从而发挥修复作用。还发现芍药苷的保护作用是通过诱导自噬、抑制凋亡和氧化应激，通过靶向 p38 下调 MAPK/mTOR 信号实现的。尽管存在一些局限性，但本研究结果进一步填补了芍药苷在 DILI 防治中的空白，可能有助于促进芍药苷临床应用的发展。

Deng X, Li Y, Chen Y, Hu Q, Zhang W, Chen L, Lu X, Zeng J, Ma X, Efferth T. Paeoniflorin protects hepatocytes from APAP-induced damage through launching autophagy via the MAPK/mTOR signaling pathway. Cell Mol Biol Lett. 2024 Sep 7;29(1):119. doi: 10.1186/s11658-024-00631-4.

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