Autophagy-if14+: 儿茶素EGCG促进FTO降解保护胰腺β细胞免受过度自噬诱导的损伤以防治糖尿病

(-)-表没食子儿茶素 3-没食子酸酯 (EGCG) 是绿茶中最主要的活性儿茶素，在胰腺胰岛和 β 细胞保护方面表现出广泛的功能特性。EGCG 对由糖毒性、细胞因子、铁超载、急性二恶英毒性和慢性重度饮酒引起的 β 细胞凋亡和功能障碍具有保护作用。前期发现糖皮质激素受体（以下简称NR3C1）/肥胖相关基因（fat mass and obesity associated protein，FTO）轴介导过度自噬诱发β细胞功能障碍（Autophagy. 2023; 19(9): 2538-2557）。

2024年6月24日，南京医科大学韩晓、陈芳及吴倜珺团队在Autophagy杂志在线发表题为"(-)-Epigallocatechin 3-gallate protects pancreatic β-cell against excessive autophagy-induced injury through promoting FTO degradation”的研究论文。揭示绿茶的主要生物活性成分表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）通过靶向诱导FTO泛素-蛋白酶体降解纠正胰岛β细胞过度自噬，维稳β细胞功能，为饮茶能降低糖尿病风险提供了新证据。

摘要

过度的巨自噬/自噬会导致胰岛β细胞功能衰竭，从而促进糖尿病的发展。我们之前的研究证明，有害的过度自噬的发生归因于糖脂毒性诱导的NR3C1激活。在本研究中，我们探索了(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)在体内对β细胞特异性NR3C1过表达小鼠和体外NR3C1增强的β细胞的潜在保护作用。我们发现EGCG通过抑制过度自噬来保护胰岛β细胞免受NR3C1增强诱导的失败。RNA去甲基化酶FTO (FTO α -酮戊二酸依赖双加氧酶)导致三种促氧化基因(Tlr4, Rela, Src) mrna的m6A修饰减少，从而发生氧化应激;相反，在nr3c1增强的β细胞中，EGCG通过泛素-蛋白酶体系统促进FTO降解，从而减轻氧化应激，从而防止过度自噬。此外，FTO过表达可消除EGCG对NR3C1诱导的β细胞损伤的保护作用。综上所述，我们的研究结果表明，EGCG通过抑制fto诱导的氧化应激来保护胰岛β细胞免受NR3C1增强诱导的过度自噬，这为EGCG的抗糖尿病作用机制提供了新的思路。

1.EGCG 可改善 β 细胞特异性 NR3C1 过表达小鼠的葡萄糖耐受性和 β 细胞功能

既往研究表明，NR3C1在T2D患者和糖尿病小鼠的胰岛中增强和过度激活，从而导致胰岛β细胞功能障碍和凋亡。在本研究中，EGCG对β细胞特异性nr3c1过表达(βNR3C1)小鼠的影响，这些小鼠表现出显著的血糖水平升高和糖耐量受损。然后将所有手术小鼠随机分为4组:对照组(aav载体感染)给予EGCG或磷酸盐缓冲液(PBS)灌胃，βNR3C1小鼠(AAV-RIP2-NR3C1感染)给予EGCG或PBS灌胃，并安排实验以确定EGCG对βNR3C1小鼠的影响(图1A)。在EGCG给药过程中，βNR3C1小鼠的糖尿病相关表型逐渐改善，表现为14周龄和18周龄的血糖下降(图1B -)， 15周龄和19周龄的葡萄糖耐受不良减轻(图1D -)，而PBS或EGCG灌胃的ctrl小鼠未观察到组间变化。同样，在给予EGCG的βNR3C1小鼠中，胰岛素分泌水平显示显著反弹(图1H)。需要注意的是，对于βNR3C1小鼠，EGCG并没有干扰β细胞中NR3C1的过表达(图1J)。进一步通过体外胰岛灌注实验评估了EGCG对βNR3C1小鼠β细胞功能的影响。nr3c1过度激活显著抑制高葡萄糖偶联胰岛素分泌，此可被EGCG口服逆转(图1K)。此外，注意到口服EGCG也有效地保护了β细胞免受nr3c1诱导的凋亡(图1M)。EGCG对NR3C1过度激活诱导的β细胞衰竭和糖尿病具有保护作用。

图 1.EGCG 可改善 β 细胞特异性 NR3C1 过表达小鼠的葡萄糖耐受性和 β 细胞功能

2.EGCG可逆转NR3C1激活诱导的胰岛β细胞衰竭

接下来，使用人胰岛和MIN6细胞来研究EGCG对nr3c1激活的β细胞的直接作用。灌注分析表明，在过表达NR3C1的人胰岛中，给予EGCG可有效改善第1和第2时相的胰岛素分泌(图2A)。然后，使用醛固酮(ALD)或地塞米松(DEX)(这两种药物均为NR3C1激动剂)处理人胰岛和MIN6细胞，以建立NR3C1过度激活的模型。如图2D,E所示，EGCG可以显著恢复ALD或dex处理的β细胞中受损的胰岛素分泌和胰岛素含量。与此平行，经ald处理的人胰岛的胰岛素分泌减少可以被EGCG部分逆转(图2F,G)。此外，EGCG还可以改善ALD或DEX处理的MIN6细胞的活力下降(图2H)。流式细胞术和TUNEL检测进一步证明，egcg减少了ald处理的MIN6细胞(图2I)和人胰岛(图2J)中的β细胞凋亡。综上所述，这些结果表明，EGCG减轻了NR3C1过度激活引起的β细胞衰竭。

图2 EGCG可逆转NR3C1诱导的胰岛β细胞衰竭

3.EGCG通过抑制过度自噬保护胰岛β细胞免受NR3C1诱导的凋亡

我们前期研究表明，自噬过度激活参与了NR3C1增强诱导的胰岛β细胞功能障碍和凋亡。然后，确定EGCG是否通过调节自噬来减轻nr3c1诱导的β细胞功能障碍和凋亡。在βNR3C1小鼠中，NR3C1过表达增加了胰腺中MAP1LC3/ lc3 -ⅱ阳性和SQSTM1/p62阴性细胞的数量，这与预期的胰岛素阳性细胞数量一致，而EGCG的使用减弱了这些变化(图3A,B)。此外，βnr3c1小鼠β细胞的透射电子显微镜(TEM)图像显示自噬空泡聚集，EGCG给药后明显减轻(图3C,D)。因此，用或不用EGCG处理NR3C1过表达的MIN6细胞，发现NR3C1过表达导致LC3-II表达增加，但SQSTM1蛋白水平降低，这一情况被EGCG部分逆转(图3E)。mRFP-GFP-LC3的免疫荧光染色也证实，在MIN6(图3F)和INS1细胞(图3G)中，EGCG抑制NR3C1增强诱导的自噬的过度激活。EGCG对nr3c1刺激的细胞凋亡增加(图3H)和胰岛素分泌受损(图3I)的保护作用在雷帕霉素(一种自噬激活剂)处理的人胰岛和MIN6细胞中被消除。总之，EGCG通过抑制过度自噬保护胰岛β细胞免受NR3C1增强诱导的凋亡。

图3 EGCG通过抑制过度自噬保护胰岛β细胞免受NR3C1增强诱导的凋亡

4.EGCG促进NR3C1增强激活的β细胞FTO降解

据报道，EGCG可抑制FTO的表达，而FTO可导致NR3C1增强诱导的β细胞过度自噬和功能障碍。在本研究中，利用分子对接的方法研究了FTO和EGCG之间的相互作用。EGCG与FTO的对接评分为- 9.0 kcal/mol, EGCG通过与ARG96和ALA224形成特定氢键介导的复合物，以及与PRO93、VAL225、ILE85、LEU109和HIS228的5个Pi相互作用，与FTO蛋白形成紧密结合(图4A)。然后，检测了EGCG是否调节慢性高糖(HG)和棕榈酸(Palm.)处理的β细胞中FTO的表达(即糖脂毒性)，这已经被证实激活NR3C1。EGCG可以阻止糖脂毒性引起的β细胞FTO表达的增加，而对NR3C1表达的增加没有影响(图4B)。EGCG对来自T2D受试者的胰岛的处理导致β细胞中FTO表达的降低(图4C)。此外，EGCG在体内外均抑制了nr3c1过表达β细胞中FTO蛋白水平的升高(图4D,E)。随后应用了放线菌酮(CHX，蛋白质合成抑制剂)，发现EGCG显著促进过表达nr3c1的MIN6细胞中FTO的降解(图4F)。有证据表明，溶酶体和蛋白酶体途径均参与内源性FTO的降解。评估了溶酶体抑制剂和蛋白酶体抑制剂对NR3C1过表达和EGCG处理的MIN6细胞的影响。当蛋白酶体被MG132抑制时，EGCG对FTO降解的作用被消除(图4G)。相反，在EGCG处理下，溶酶体抑制剂氯喹(CQ)对FTO的降解没有影响(图4H)。然后，检测了在EGCG处理下NR3C1过表达的MIN6细胞中FTO是否被泛素化。在基础状态下，EGCG对MIN6细胞的FTO泛素化没有影响，但在nr3c1过表达的情况下，EGCG刺激了FTO泛素化(图4I)。根据这些数据，EGCG在翻译后水平减弱nr3c1诱导的FTO表达。

图4 EGCG促进NR3C1增强激活的β细胞FTO降解

5.EGCG通过抑制FTO的表达抑制nr3c1诱导的氧化应激

EGCG是一种多酚，因其抗氧化特性而闻名，可保护β细胞免受氧化损伤。之前的RNA-seq实验表明，参与氧化磷酸化、线粒体生物发生、线粒体呼吸链复合体和氧化应激反应的线粒体基因在过表达NR3C1的MIN6细胞中失调。为了进一步探究NR3C1过表达是否引起氧化应激，通过荧光探针DHE评估了之前研究中重要的氧化剂超氧化物阴离子(O2.-)的水平。在βNR3C1小鼠中，NR3C1过表达导致O2显著增加(图5A,C)，以及4-HNE(4-羟基壬烯醛)和8-OHdG(8-羟基-2 ' -脱氧鸟苷)，这两种氧化应激标志物可被EGCG逆转(图5B,C)。透射电镜观察到，β nr3c1小鼠的β细胞出现明显的线粒体损伤，表现为线粒体内嵴结构的破坏，同时，过表达nr3c1的β细胞线粒体数量明显减少。然而，这种损伤在EGCG治疗后可以显著改善(图5D,E)。通过测定βNR3C1小鼠胰岛葡萄糖为ATP的有氧代谢速率(OCR)，评估过表达NR3C1的β细胞线粒体氧化磷酸化活性。结果表明，βNR3C1小鼠胰岛的基础呼吸、ATP生成和最大呼吸能力受损，EGCG处理可以改善这一情况(图5F)。为了研究线粒体呼吸的减少是否是由线粒体电子传递链引起的，测定了线粒体复合物的表达。来自βNR3C1小鼠的胰岛显示出复合物I和复合物III的蛋白水平明显降低，这一水平在EGCG进一步处理后减弱(图5G)。EGCG对nr3c1诱导的线粒体功能障碍具有保护作用。因为线粒体功能障碍常导致氧过量。评估了EGCG在nr3c1诱导的氧化应激中的作用。EGCG可降低过表达NR3C1的MIN6细胞中的产生和NO释放(图5H)。这些数据表明，EGCG可以预防NR3C1增强诱导的氧化应激。

图5 EGCG对NR3C1诱导的线粒体功能障碍和氧化应激具有保护作用

有报道FTO过表达可增强胰岛β细胞的氧化损伤。为了验证FTO是否参与nr3c1诱导的氧化应激，我们下调β细胞中FTO的表达（图6A ），FTO敲低导致O2降低， nr3c1过表达的β细胞的产生和NO释放。我们之前的MeRIP-seq实验表明，NR3C1增强诱导的m6A修饰改变的显著GO分类(p < 0.05)与氧化应激过程相关(图6A)。结合Fan等发表的全转录本芯片，我们重点关注了3个基因，即Tlr4 (toll-like receptor 4)、Rela/NFKB p65 (v-rel网状内皮细胞增生症病毒癌基因同源物A (v-rel reticuloendotheliosis viral oncogene homolog A (avian))和Src (Rous肉瘤癌基因)。在nr3c1过表达的MIN6细胞中，MeRIP-seq显示这3个基因的m6A修饰下降，而在FTO过表达的MIN6细胞中，转录组学研究显示它们的表达水平明显升高，表明Tlr4、Rela和Src可能在FTO调控nr3c1诱导的氧化应激中发挥重要作用。图6B-D显示了Tlr4、Rela和Src转录本3 ' -非翻译区(UTR)内m6A修饰的变化。RT-qPCR和MeRIP-qPCR检测显示，fto敲低显著消除了NR3C1过表达MIN6细胞中Tlr4、Rela和Src的上调(图6E)，同时消除了NR3C1增强引起的这些转录本上m6A水平的下降(图6F)。继续研究FTO是否参与了EGCG对nr3c1诱导的β细胞氧化应激的保护作用。根据我们的观察，EGCG防止了过度的Tlr4、Rela和Src水平(图6G)，增加了O2-过表达NR3C1的MIN6细胞产生和NO释放，这可以被FTO过表达所抑制(图6H-I)。总之，这些结果证实了抑制FTO的表达是EGCG在nr3c1诱导的氧化应激中发挥抗氧化作用的原因。

图6 EGCG对nr3c1诱导的氧化应激的抗氧化作用与抑制FTO有关

7.EGCG通过改善氧化应激抑制fto诱导的过度自噬

越来越多的证据表明，自噬和氧化应激以密切而协调的方式相互关联。鉴于FTO是NR3C1增强诱导的氧化应激和过度自噬的原因，研究了氧化应激和自噬在FTO过表达的β细胞中的相互关系。值得注意的是，NAC处理部分阻止了FTO过表达诱导的LC3-II增加和SQSTM1蛋白水平降低(图7A)。此外，NAC处理有效地消除了fto过表达β细胞中自噬流的增加(图7B)。此外，fto过表达的小鼠胰岛显示出自噬结构数量显著增加，而NAC孵育可减弱自噬结构数量(图7C)。接下来，使用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)探讨自噬在fto诱导的氧化应激中的作用。尽管在fto过表达的β细胞中，3-MA处理消除了LC3-II:I比例的升高和SQSTM1表达的降低(图7)，但对O2 -和no的产生无影响(图7E-F)。这些数据表明，FTO过表达增强了氧化应激，从而导致自噬过度活跃。有趣的是，H2O2处理显著逆转了EGCG对fto诱导的过度自噬的作用，而雷帕霉素没有改变EGCG对fto诱导的O2 -和NO产生的影响(图7G-I)。

图7 EGCG通过改善氧化应激抑制fto诱导的过度自噬

8.EGCG对NR3C1激活诱导的β细胞损伤具有保护作用，其机制可能与下调FTO有关

进一步验证了FTO是否参与了EGCG对NR3C1诱导的β细胞损伤的保护作用。EGCG可逆转慢性高糖和Palm对MIN6细胞胰岛素分泌和/或胰岛素含量的影响。而FTO过表达可消除上述作用(图8A-B)。此外，EGCG对糖脂毒性诱导的β细胞凋亡的保护作用(图8C)在过表达FTO的MIN6细胞中几乎被消除。在INS1细胞中也观察到类似结果(图8D-F)。还观察到FTO过表达可以取消EGCG对ALD或DEX处理的MIN6细胞的保护作用(图8G-H)。这些结果表明，下调FTO是EGCG保护β细胞免受NR3C1激活引起的损伤的机制之一。

图8 EGCG对NR3C1激活诱导的β细胞损伤具有保护作用，其机制可能与下调FTO有关

结论

综上所述，研究结果表明，在nr3c1过表达的β细胞模型中，EGCG促进了FTO的降解，从而以m6a依赖的方式导致促氧化基因表达的降低和ROS的积累，从而挽救了过度自噬诱导的β细胞衰竭和糖代谢受损。这些发现为EGCG在β细胞中发挥抗自噬作用提供了新的视角，并为EGCG的抗糖尿病作用机制提供了新的见解。

Shao Y, Zhang Y, Zou S, Wang J, Li X, Qin M, Sun L, Yin W, Chang X, Wang S, Han X, Wu T, Chen F. (-)-Epigallocatechin 3-gallate protects pancreatic β-cell against excessive autophagy-induced injury through promoting FTO degradation. Autophagy. 2024 Jul 3:1-18. doi: 10.1080/15548627.2024.2370751.