孙奋勇教授：分子诊断创新技术研究前沿

在现代医学领域，分子诊断技术正逐渐变革着我们对疾病的理解与治疗。随着生物医学研究的不断深入和生物技术的快速发展，一系列创新的分子诊断原理和技术层出不穷，它们以前所未有的精度和速度，为疾病的早期发现、准确分型、治疗监测以及预后评估提供了强有力的工具。

今天，检验君为大家带来的是同济大学附属第十人民医院孙奋勇教授团队近年来关于分子生物技术的研究进展。

DNA纳米骰子实现分子计算模拟和操控

骰子投掷，作为一种随机模型，可以通过改变条件来表示不同概率的事件，以执行某些逻辑运算，但在分子尺度上实现这一过程还从未报道。DNA由于其高度平行的结构，可以准确地进行预测和组装，被认为是一种理想的智能纳米材料，用于构建具有动态功能的纳米级分子机器人。

日前，同济大学附属第十人民医院孙奋勇教授、朱小立教授，上海交通大学附属上海儿童医学中心潘秋辉教授团队的一项研究，基于立方体结构的DNA框架和氧化石墨烯的特殊性能，构建人工纳米骰子系统，为DNA技术在分子计算模拟提供了新的模型。该研究发表在Nature communications（IF:14.7）。

该人工纳米DNA骰子系统主要由两部分组成:以DNA链条组装形成的规则立方体骰子骨架和以氧化石墨烯（GO）为投掷平台。四条单链DNA (ssDNA)寡核苷酸从立方体的四个相对顶点“伸出”，用荧光标记，代表4种不同信号，根据排列组合可以表示六个面，检测荧光信号的种类便可判定骰子投掷结果。在最佳GO/骰子比下，通过观察4种荧光分子在GO上的猝灭情况，成功验证该模型系统的随机性。

接下来，该研究通过熵驱动的链置换反应定向操纵骰子，实现人工翻转，通过不同短互补单链DNA（c-DNA）和互补的c-DNA寡核苷酸（cc-DNA）偶联的组合应用，在纳米尺度上模拟了骰子从一个特定点到另一个点的操作过程，实现对DNA纳米粒子的有效合理控制。

然后，研究人员通过改变碱基组成或通过化学修饰来影响ssDNA与GO的结合亲和力，成功让DNA骰子在纳米尺度上能掷出指定数字。

研究人员表示，该DNA纳米骰子装置为分子模拟、纳米器件应用提供了新的策略，有望应用于智能分子器件，在微观层面上执行复杂的任务，如逻辑电路、颜色编码，也可用作传感器输出或分子驱动器触发下游生物分子过程。

文章链接：

https://www.nature.com/articles/s41467-023-38164-7

柔性核酸折纸技术实现mRNA药物单分子递送

mRNA在各种疾病的治疗中显示出很高的应用价值，但是能否有效传递仍然是目前面临的主要挑战。研究表明，将大分子线性mRNA包裹在纳米载体中，能够获得更好的传递稳定性。

日前，同济大学附属第十人民医院孙奋勇教授、朱小立教授，同济大学附属同济医院葛步军教授团队提出了一种用于mRNA递送的灯笼状柔性核酸折纸技术。该技术仅用两个环状Staple RNA，能够保留mRNA的大部分活性区域，从而确保其翻译效率；实现了Smad4 mRNA靶向递送至结直肠癌细胞和胞内Smad4蛋白翻译表达，有效抑制了结直肠癌的生长进程。该研究发表在Nature Communications（IF: 14.7）。

传统核酸折纸技术以数百个线性寡核苷酸作为主体，折叠形成紧密的双链结构，用于mRNA纳米化，但不能有效地释放mRNA进一步表达蛋白质。该研究采用两个定制的圆形RNA来间歇固定Smad4 mRNA的几个关键位点，使之形成三维灯形纳米结构。在此模型中，Smad4 mRNA既是被递送的药物，也是支撑该折纸结构的骨架，且mRNA的大部分区域能保持单链结构和相应活性。

RGD肽能特异性结合CRC细胞膜上过表达的整联蛋白。研究人员用RGD肽修饰RNA序列，赋予该折纸结构以靶向能力，经细胞摄取后，Smad4 mRNA可被胞浆中的核糖体识别，竞争性地从纳米结构中分离出来，有效表达编码的蛋白质。

研究人员分别进行了体外和体内实验，验证该灯形RNA折纸靶向递送mRNA和抑制肿瘤发展的效率。结果显示，该灯形折纸模型能够实现Smad4 mRNA的CRC靶向递送，上调Smad4的表达水平，有效抑制CRC肿瘤生长。

研究人员表示，该方案为基于mRNA的肿瘤治疗提供了有潜力的递送方法；未来，可探索构建不同的柔性折纸结构，以传递不同的RNA，甚至可以在柔性折纸的结构和功能方面运用计算机辅助设计和人工智能模拟等技术，以设计更加有力的工具。

文章链接：

https://www.nature.com/articles/s41467-023-37020-y

DNA荧光编码（FLUCO）实现51色生物成像分析

颜色编码在绘图、数字摄影、光谱分析等领域发挥着至关重要的作用。在分子水平上实现精确的、靶标响应的颜色编码有望在组学分析、信息存储和分子索引等革命性领域发挥重要作用。

近日，同济大学附属第十人民医院孙奋勇教授、朱小立教授、李文星团队开发了一个基于计算机辅助设计（CAD）的多位DNA自组装技术FLUCO。该技术可以精确编码51种颜色，使用传统的成像设备对超出通道限制的多个靶标同时成像，在空间蛋白质组学成像和多靶标分析等领域具有巨大的应用潜力。该研究发表在Journal of the American Chemical Society（IF: 14.4）。

该技术可以精确编码51种颜色，打破荧光通道的限制，提高了检测通量。通过进一步增加编码位数和荧光基团数，可进一步扩大其通量。此外，该研究用计算机辅助序列设计取代传统的手工序列设计，并开发计算机视觉辅助信号解码技术，使FLUCO实现可定制、智能及自动的编码设计和解码过程，有效地解决了人工编码和解码分析耗时耗力的问题。研究人员成功将FLUCO技术应用于核酸和蛋白靶标的液体活检，并验证了该技术在单细胞内多蛋白靶标原位空间成像中的应用和实现潜力。

总之，该研究表明，通过改变靶标类型，FLUCO技术有望成为脱落细胞分析、转录组分析、RNA表观遗传学分析等应用的有力工具。

文章链接：

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.4c00811

基于工程仿生传感器的溶血病原菌生物效应丰度分析

传统的基于生物标志物分子结构或化学特性的病原体检测策略只能提供微生物的“物理丰度”，而不能真实反映“生物效应丰度”。“生物效应丰度”是指测量病原体的生物效应，可以更准确地评估病原体的致病性，从而为治疗决策和公共卫生干预提供信息。

近期，同济大学附属第十人民医院孙奋勇教授联合同济大学附属上海第四人民医院满秋红教授团队，构建了一种与CRISPR-Cas12a（EMSCC）级联的红细胞膜包裹的仿生传感器，用于溶血病原体生物学效应检测，能够敏感地应对病原体的致病性变化。该研究发表在Biosensors & Bioelectronics（IF: 10.7）。

溶血性细菌是一类能够破坏细胞膜的病原体，主要通过分泌形成孔隙的毒素破坏宿主细胞的细胞质磷脂双层膜，导致靶细胞膜去极化，引起细胞肿胀溶解。溶血细菌的孔形成生物学效应在细菌发病机制中起重要作用，检测细菌的溶血活性可以反映细菌的致病性。

因此，研究人员选择溶血细菌作为研究模型，采用红细胞膜作为仿生传感器的材料，构建了红细胞膜包裹的仿生传感器，只有当目标病原体处于活跃状态时才能与EMSCC发生反应，发挥其生物学效应，从而释放包裹在红细胞膜中的信号物质。然后，释放的信号物质通过级联CRISPR-Cas12a放大信号，检测灵敏度比传统的红细胞溶血试验提高了6.67×104倍以上。随后基于EMSCC进行模拟临床样本的检测，在40个样本中获得了95%的准确率，证明了其潜在的临床价值。

研究人员表示，与只能进行物理定量的PCR或ELISA等传统方法相比，该方法可以模拟和评估各种环境中病原体的致病性，为病原体的生物效应丰度分析提供技术支持。

文章链接：

https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S095656632300444X?via%3Dihub

CAD-HCR应用于单细胞空间蛋白质组学成像

蛋白质亚细胞定位的变化与大多数细胞过程有关，定位错误常常导致细胞功能不良和疾病的发生。蛋白质在亚细胞尺度上的定位和定量研究属于蛋白质组学的一个分支，即空间蛋白质组学。由于通量不足和现有技术的敏感性，单个细胞的原位空间蛋白质组学分析尚未实现。

日前，同济大学附属第十人民医院孙奋勇教授、朱小立教授，上海交通大学分子医学研究院院长谭蔚泓教授，上海交通大学分子医学研究院杨宇教授团队的一项研究，报道了一种涉及计算机辅助设计（CAD）和可逆组装的杂交链式反应（HCR）技术，有望应用于单细胞空间蛋白质组学分析。该文章发表在Science Advances（IF: 11.7）。

该研究开发了一种可逆HCR，与成熟的DNA交换技术相结合，利用CAD构建了可扩展序列数据库，并通过与免疫识别偶联，使CAD-HCR成功应用于单细胞水平的空间蛋白质组学的敏感成像分析。

研究人员采用荧光染料修饰HCR的发夹来验证其放大效应。与未扩增组相比，经过扩增后的信号放大了65倍，大大有利于后续的成像；同时，用荧光染料修饰HCR的两个发夹，可实现额外信号放大，证明可逆HCR在放大效率上的可扩展性。此外，蛋白丰度与可逆HCR荧光强度正相关，表明可逆HCR可用于靶蛋白的半定量分析。

随后，对可逆HCR循环成像能力进行探究。10个周期中，几乎显示相同的染色模式，表明在不影响细胞形态的情况下实现了染色和脱色循环；荧光强度定量分析显示循环期间信号输出稳定，表明一级抗体抗原性和引发剂杂交能力不受影响。除此之外，可逆HCR消除了传统荧光技术无法消除的不可逆信号衰减，赋予样品高度重复使用性。

最后，该研究对单个细胞内分布在不同亚细胞位置的9种蛋白质进行多重成像分析，结果显示，9种蛋白质的亚细胞分布与其理论位置十分吻合，亚细胞蛋白多重成像结果与亚细胞位置共定位良好，表明可逆HCR在亚细胞尺度上对蛋白空间定位具有很高准确性。

总之，CAD-HCR丰富了单细胞分析和蛋白质组学分析的工具箱，在临床诊断学和生物医学研究方面具有强大的应用潜力。研究人员表示将进一步优化整体程序，将其应用于临床检测，该方法也有望推广到其他组学相关的研究，如芯片分析、复杂系统的液体活检等。

文章链接：

https://www.science.org/doi/full/10.1126/sciadv.abk0133?rfr_dat=cr_pub++0pubmed&url_ver=Z39.88-2003&rfr_id=ori%3Arid%3Acrossref.org

纳米精子载体超快速递送反义DNA

当前，许多纳米材料被设计成为细胞内递送工具，但其合成过程复杂且耗时，应用领域也相对有限，集中在生物传感或细胞成像领域，限制了纳米材料作为胞内递送工具的发展。

日前，同济大学附属第十人民医院孙奋勇教授、朱小立教授联合上海交通大学附属上海儿童医学中心潘秋辉教授团队的一项研究开发了一种新的纳米递送系统，具有更低的细胞毒性和更高的生物相容性，因其形状像精子，被称为“纳米精子”。该研究发表在Nanoscale（IF:5.8）。

该研究使用DNA寡核苷酸作为骨架，合成头部具有银纳米簇、尾部具有功能性片段的纳米结构。研究人员分析了携带不同结构DNA的“纳米精子”用于成像或肿瘤治疗的可能性，以DNA模板纳米簇为递送载体，实现超快递送和成像/治疗的双重功能，为肿瘤治疗提供了一种新思路。

总之，纳米精子”系统的开发为肿瘤治疗提供了一种新的高效传递策略，有望在生物传感、细胞成像以及治疗领域带来革命性的创新。

文章链接：

https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2022/nr/d2nr02050e

专家简介

孙奋勇 教授

教授/研究员，同济大学附属第十人民医院副院长。教育部新世纪优秀人才，上海市领军人才，上海市卫健委优秀学科带头人。上海医学会理事、上海医学会分子诊断专科分会主委、上海医学会检验学分会秘书长。上海市检验专科联盟盟主，中国医师协会检验医师分会委员，上海实验医学研究院分子诊断创新技术研究所所长，同济大学分子医学检测技术研究中心主任。

第一或通讯作者在Hepatology、Nature Communication（ 3）、Nucleic Acid Research（3）、Molecular cancer、Science Advance 等著名期刊发表SCI论文59篇，主持国家“十二五重大新药创制”，973（组长），国自然基金重点项1项，面上项目6项，上海市重大项目2项，授权专利6 项。独创国际首个新药治疗子宫内膜异位症（注册一期临床阶段），完成分子诊断产品转化1000万。

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编辑：唐强虎 审校：方琪