Nature丨肥胖大脑“编织”的秘密——神经纤维网如何在肥胖中长成？

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肥胖和2型糖尿病等代谢性疾病的特点是胰岛素抵抗（insulin resistance），胰岛素抵抗与外周组织的细胞外基质（extracellular matrix, ECM）重塑密切相关。在这些组织中，过多的ECM沉积（即纤维化现象）会损害胰岛素的作用和信号传导。人们一般认为纤维化只发生在外周组织中，然而当发生急性脑损伤和一些神经系统疾病后，大脑中也会观察到ECM重塑现象。

下丘脑弓状核（arcuate nucleus of the hypothalamus, ARC）内的细胞是控制新陈代谢的关键区域，但其在代谢疾病发展过程中会变得对胰岛素抵抗，但这些机制尚不完全清楚。最近的研究发现，在神经元成熟过程中，ARC区域的表达有食欲素相关肽（agouti-related peptide, AgRP）的神经元周围形成了独特的ECM亚型，称为神经元周围网（perineuronal nets, PNNs）。这种PNN的形成直接影响AgRP的功能，因为其丢失会导致纤维密度增加和细胞数量变化。PNN和ARC细胞之间的内在关系可能揭示了神经内分泌轴控制新陈代谢的基本机制。最近的一项观察结果进一步强调了ECM在代谢中的重要性，即中央隆起median eminence（ARC附近的区域）中的ECM可以根据营养状况进行暂时的重塑。鉴于纤维化与外周组织细胞功能障碍之间的关联，ARC中的ECM重塑可能代表了一种完全未被探索的代谢性疾病发病机制。

来自墨尔本大学的Garron T. Dodd团队发现在Nature上发表论文Pathogenic hypothalamic extracellular matrix promotes metabolic disease，研究发现在代谢性疾病发展过程中，ARC周围的ECM会增多和重塑，并且阻碍胰岛素进入细胞，最终导致胰岛素抵抗。研究团队通过拆解肥胖和2型糖尿病小鼠ARC区域的病理性ECM，缓解了相关的疾病，并证实ARC区域的ECM重塑是代谢性疾病的病理机制和治疗靶点。

图源 Nature

通过紫藤花凝集素（Wisteria floribunda lectin, WFA）染色，研究人员发现PNN在老鼠的脑部中枢区域（下丘脑）中普遍存在，且在ARC区域尤为明显。高脂高糖饮食的小鼠ARC中的PNN染色面积和强度显著增加，表明这与代谢疾病的发病机理相关，且这种变化仅发生在ARC，而不发生在其他脑区（如后扣带回皮质 retrosplenial granular cortex, RSG或腹内侧下丘脑 ventromedial hypothalamus, VMH）。由于外周组织内ECM的病理增强和重塑被称为纤维化，故将这种ARC区域过度的PNN沉积和重塑现象称为神经纤维化。

图1 肥胖会导致ARC区域的神经纤维化

研究发现，在神经纤维化中ARC区域的PNN的组成重塑中，透明质酸在脑实质中的染色不均匀，且在DIO小鼠中ARC染色面积和强度增加。同时，透明酸和蛋白多糖链蛋白（hyaluronic and proteoglycan link proteins, HAPLN1）以及硫酸软骨素蛋白聚糖（chondroitin sulfate proteoglycan, CSPG）的丰度也增加。这些细胞外基质组件在整个下丘脑中表达，表明它们在ARC区域PNN以外的ECM中同样具有功能。研究人员还发现，肥胖促进了aggrecan、versican、neurocan和brevican等主要硫酸软骨蛋白组件的增加，其中aggrecan是神经纤维化中主要的硫酸软骨蛋白种类。

ARC中有两个与新陈代谢相关的神经元群体：AgRP神经元和POMC（pro-opiomelanocortin）神经元。在Npy-GFP和Pomc-GFP小鼠中，当它们在正常饲养条件下，45%的AgRP神经元和24%的POMC神经元会被周围的PNN包围。在代谢性疾病进展过程中，AgRP神经元周围的PNN增加，伴随着WFA和aggrecan染色的增强，而神经元数量没有变化。这些结果表明，代谢性疾病发展过程中AgRP神经元的周围出现会神经纤维化。

PNNs在描述中表现出缓慢的生物更新率，并能在成年组织中持续存在几个月到几年，但研究结果表明，在暴露于致肥胖饮食后，ARC区域PNN的重塑和增强速度相对较快。为了实验性地确定体内PNN的更新率，研究团队开发了PNN追踪器（PNN tracker），这是一种利用立体定位注射生物素化WFA（WFA-biotin）来脉冲且标记感兴趣的大脑区域中的PNN的脉冲追赶方法。首先，研究人员通过单侧注射生物素标记的WFA到小鼠ARC区域，标记PNN，一天后取脑组织进行免疫组化检测，观察生物素标记的PNN（旧PNN）和FITC标记的总PNN（新旧PNN）的分布情况。然后研究人员将小鼠分为正常饮食组和高脂高糖饮食诱导肥胖组，在两组小鼠ARC区域双侧注射生物素标记的WFA，并在不同时间点（0天、1周、3周、5周、10周）取脑组织进行免疫组化分析。通过定量分析生物素标记PNN和总PNN的比例变化，利用PNN tracker技术可以实时监测PNN的动态变化，用以评估ARC中PNN的周转速率。

图2 ARC中PNN转换的减弱驱动神经纤维化

研究团队还进行了饱食序列行为实验（Behavioural satiety sequence）的动物行为学实验。首先将预先称重的食物放置在单独饲养的小鼠笼中，在实验开始后的90分钟内，每隔30秒记录一次小鼠的行为，包括进食、饮水、梳理、休息、活动和静止等行为，并通过分析这些行为数据，对小鼠的进食行为、饱食时间等指标进行评估。具体而言，研究人员首先将小鼠在断食过夜后，于光照周期开始2小时后（即上午9点）放入实验笼中，并给予充足的食物。随后对小鼠的行为进行观察记录，每30秒记录一次小鼠的行为状态。最终将这些数据整理成以5分钟为单位的时间段，并分析小鼠在各种行为上所占的平均百分比、进食量、从进食到休息的转换时间，以及饱食时间（进食行为频率与休息行为频率相交的时间点）等指标。通过这种细致的行为观察和数据分析，可以全面评估小鼠的进食行为模式和饱食状态，而这些行为学数据也为后续探讨大脑神经元微环境的变化如何影响动物的进食行为和代谢功能提供了重要依据。

图3 ARC内神经纤维瘤的分解可以缓解代谢疾病

此外，在该研究中，研究团队还开展了一些生化分析手段，如定量分析ARC区域内GFP阳性神经元，检测GAG和透明质酸二糖（hyaluronic acid disaccharide）等，以此定量评估大脑ARC区域GAG组成的变化,为探讨神经元微环境的重塑提供重要依据。

图4 肥胖导致的神经纤维化会促进ARC胰岛素抵抗

图5 鼻腔给药神经纤维化抑制剂可以缓解代谢疾病

该研究发现，在高脂高糖饮食诱导的肥胖小鼠模型中，大脑ARC区域PNN的面积和强度会随时间逐渐增加，表明肥胖会导致该区域神经纤维化的发生。进一步分析发现，PNN的主要成分凝集素也会随着肥胖的发展而发生变化，表明肥胖引起的神经纤维化可能还涉及PNN的组成改变。

为了更好地理解PNN动态变化的机制，研究团队提出了一种名为“PNN Tracker”的新型成像技术，可用于实时监测肥胖条件下大脑弓状核（ARC）中神经纤维网（PNN）的动态变化。对研究人员利用PNN Tracker技术对肥胖小鼠及其对照组的PNN的周转速率进行监测，其结果显示，在肥胖小鼠中，ARC区域PNN的周转速率明显降低，说明肥胖抑制了PNN的重塑过程。同时研究还发现肥胖条件下ARC区域细胞外基质调节酶的表达也发生了改变，这可能是导致PNN重塑受阻的潜在机制。

这些发现为进一步探究肥胖引起的大脑神经纤维化机制提供了重要依据。PNN Tracker技术的建立不仅可以实时监测PNN的动态变化，还可以用于评估治疗干预对PNN重塑的影响。未来的研究可以进一步利用这一技术，探索调节PNN重塑的潜在治疗靶点，为肥胖相关神经退行性疾病的预防和治疗提供新的思路。此外，研究人员还发现，通过抑制ARC区域神经纤维化，可以改善肥胖小鼠的代谢和葡萄糖稳态，这也为进一步开发针对神经纤维化的治疗策略提供了新的依据。

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