实验心得之Lipo系列质粒DNA转染试剂

由于实验室经常做质粒转染实验，接触到的质粒转染试剂也不少，就以lipo命名的几款质粒转染试剂来说，有国际权威品牌赛默飞的Lipofectamine2000和Lipofectamine3000、国内百代生物的lipofect5000，还有碧云天的lipo6000及lipo8000。虽都以lipo命名，但各家试剂的成分、转染性能等方面还是存在一定差异。赛默飞的质粒转染试剂主要以阳离子脂质体成分为主，而百代的lipofect5000则以可降解生物纳米材料研发而成。这种可降解的生物纳米材料在细胞毒性上确实要比传统的脂质体或PEI成分的转染试剂低得多，转染性能上也有着能媲美Lipofectamine3000的表现，因此，像lipofect5000该成分类型的转染试剂也逐渐显现了替代传统试剂的趋势，接下来就从以下几方面来看一下这款质粒转染试剂的性能。

一、质粒转染效率

毋庸置疑，质粒转染效率是研究者最看重的方面。以常用细胞系AAV293细胞为例，分别使用lipofect5000和Lipofectamine3000进行GFP质粒的转染，24h在荧光显微镜下观察荧光效果，结果显示，两款质粒转染试剂在AAV293细胞中的转染阳性率均可达90%以上，转染效果不分上下。

显然，以上结果似乎还不完全足以展示一款试剂的转染实力。转染性能优异的试剂不仅要有轻松转染简单细胞系的能力，对于一些难转细胞也要有能够进行有效转染的性能。以RAW264.7细胞为例的一些免疫类细胞的质粒转染一直以来都是极富挑战性的，一是由于细胞本身具有一定的悬浮特性，导致转染过程中减少了很多与转染试剂接触的机会；二是这些细胞通常都具有免疫原性，使得转染效率很难提升上去，因此，我们尝试性的用lipofect5000进行了RAW264.7细胞的质粒转染实验。为确保细胞状态，我们选择复苏传代后第四代的细胞进行实验，严格依据说明书中，使用含血清不含抗生素的培养基来铺板，在细胞融合度达到80%时进行了GFP质粒的转染。转染后24h，我们对绿色荧光蛋白的表达情况进行了观察，发现视野下有70%左右的细胞都呈现转染阳性（图3）。

当然，难转的细胞不止于免疫细胞，一些神经类的细胞也存在较大的转染难度，如人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y），目前市面上大多数质粒转染试剂对该细胞的转染效率都很低，哪怕是Lipofectamine2000/3000可能也只勉强做到10%-30%的转染效率。因而，我们在SH-SY5Y细胞上对lipofect5000的转染能力再次进行验证。结果如图所示，lipofect5000在该细胞中可做到50%以上的转染阳性率，这无疑是令人满意的结果。

二、细胞毒性

除了转染性能，一款质粒转染试剂的细胞毒性也是十分重要的。不同于普通的脂质体类或者PEI成分的转染试剂，Lipofect5000采用新型可降解纳米材料配制，或许正是得益于这种材料，在多次实验中，我们都发现Lipofect5000的实验组细胞死亡率和正常培养的细胞（即空白组）死亡率几乎一致，说明其细胞毒性是非常低的，研究者不用担心因试剂毒性而对实验结果产生影响。就以最为脆弱敏感的原代细胞来说，细胞毒性大的试剂很容易造成原代细胞的死亡，尽管Lipofectamine3000已经在质粒转染领域做的十分专业，但其本身的毒性仍然是不可忽略的，对于原代细胞的转染还是稍显勉强。但lipofect5000对原代胃癌细胞的转染还是不错的，结果也验证了其极低的细胞毒性（图6、7）。

三、操作简便

简便的实验过程无疑是很多研究者所喜闻乐见的，一款操作简单并且使用方便的转染试剂可节省很多实验中琐碎的步骤以及成本。

在检索一些脂质体类成分的质粒转染试剂时，不难发现，有很多研究者提到自己的转染经验，都建议在转染开始前换成无血清培养基，再在转染后4-6小时更换为含血清的培养基，一是因为血清中含有大量蛋白质，转染过程中，带负电的蛋白会干扰阳离子脂质体对DNA的吸附，影响转染效率；二是因为这些血清中的蛋白质被带入细胞后会引发细胞毒性，造成细胞死亡，而所谓的“换液”，其目的就是减轻转染造成的细胞毒性。我们在使用Lipofectamine2000/3000的试剂时，确实也观察到有血清和不换液对转染结果造成的这些影响，而lipofect5000或许成分为非脂质体加上毒性低，血清并不会影响其转染结果，转染后4-6小时不换液也不会导致细胞死亡。另外，配制转染复合物时，很多试剂要求研究者额外购买Opti-MEM或搭配无血清培养基，而lipofect5000试剂盒中配置了百代自研的Trans buffer，这点上为研究者节省了实验成本。