高福/王寒/齐建勋合作最新NAR阐述pP1192R在不同酶促阶段的结构

2024年8月中国科学院高福，北京大学王寒，中国科学院齐建勋共同通讯在Nucleic Acids Research在线发表题为“Structural basis for difunctional mechanism of m-AMSA against African swine fever virus pP1192R”的研究论文，该研究用X射线晶体学和单粒子低温电子显微镜阐述了pP1192R在不同酶促阶段的结构。为开发靶向pp1192R的抗ASFV策略提供了适用的信息。

非洲猪瘟病毒(ASFV)感染猪科的所有成员，并引起致命的非洲猪瘟(ASF)，死亡率几乎为100%。非洲猪瘟于1921年首次在肯尼亚发现，现在已在全球蔓延，影响非洲、欧洲和亚洲国家，并给全球养猪业造成严重的经济损失。非洲猪瘟病毒是唯一已知的DNA虫媒病毒，属于Asfarviridae科。它具有长度在170~190 kbp之间大的线性双链DNA基因组，编码超过150~167个开放阅读框，因此被归类为NCLDV。非洲猪瘟病毒的复杂性严重阻碍了针对非洲猪瘟病毒感染的安全有效疫苗和抗病毒药物的开发。ASFV的复制周期主要是在细胞质内，初始阶段在宿主细胞核短暂发生，大部分DNA复制发生在细胞质病毒内。因此，病毒已经进化出一种独立的复制和转录机制，其中涉及许多病毒特异性酶，如组装ATP酶、DNA聚合酶、解旋酶和基因组组装相关的组蛋白样蛋白以及拓扑异构酶。

DNA拓扑异构酶在DNA复制、转录和染色体分离过程中通过在DNA中产生瞬时断裂来调节DNA分子的拓扑结构，在古细菌、细菌、真核生物和病毒中普遍存在。DNA拓扑异构酶有两种类型，它们在单链上引入DNA断裂的能力不同(I型，Topo I)或在两个支架上引入DNA断裂的能力不同(II型，Topo II)，Topo II可以进一步细分为两个亚型，在序列、结构和来源上都不同，即以Gyrase和Topo IV为代表的细菌Topo IIA和真核生物Topo II；已知的病毒Topo I均属于Topo IIA，并已在T4噬菌体和NCLDV的几个成员(包括ASFV)中发现。得益于结构生物学的研究，从Gyrase、Topo IV和真核Topo II的角度，已经很好地确定了Topo II的催化循环机制，Topo II介导的DNA切割和Topo II抑制剂的阻断功能。

图形摘要（图源自Nucleic Acids Research）

酶的作用机制涉及三个门状二聚体界面的打开和关闭，分别被称为N门，DNA门和C门，在ATP结合和水解和DNA切割时，在DNA门中引入双链断裂的DNA (G段)，以运输另一条DNA链(T段)。已经确定的是，G段的裂解与活性位点酪氨酸的羟基作为亲核试剂攻击G段的可剪切磷酸盐形成瞬时磷酸酪氨酸键有关；共价蛋白质- DNA相互作用被称为卵裂复合体。这种亲核攻击依赖于切割活性位点的两种金属离子和酸性氨基酸，并被提出遵循许多核酸酶和转座酶深入阐明的DNA切割的经典双金属催化，同时在Topo II介导的DNA切割中发生了新的变化。在经典的双金属介导的DNA切割中，金属离子A (A2+)激活或协助催化水或核糖的羟基攻击可剪切的DNA 5 '端，而金属离子B (B2+)与DNA 3 '-氧阴离子基相互作用并促进其离开。然而，A2+和B2+在Topo II中的组织结构不同，A2+与磷酸酪氨酸的非桥接氧和DNA 3 '-氧阴离子基团相互作用，B2+远离DNA 3 '-氧阴离子基团，这使得Topo II介导的DNA切割过程不清楚。

由于拓扑异构酶在生命周期中不可替代的作用，靶向拓扑异构酶的抑制剂在临床抗菌和抗癌治疗中取得了巨大成功。Topo II抑制剂根据其不同的作用机制分为两类：毒物通过捕获或增强共价切割复合物来抑制Topo II，而催化抑制剂通过各种独立于切割复合物的机制起作用。除了它们最初的目标外，一些药物被发现具有更广泛的抑制作用。在ASFV中，已鉴定出一种功能性病毒Topo II pP1192R，该病毒由ASFV株中保守的病毒基因P1192R编码。pP1192R在ASFV感染的中后期可检测到，主要在细胞质病毒内，并且已被证实对ASFV复制很重要。siRNA或一些Topo II抑制剂抑制pP1192R均可降低病毒子代的滴度。

研究阐述了pP1192R的ATP酶结构域的晶体结构，并测定了pP1192R全长在多个酶活性阶段、载脂蛋白和DNA切割状态下的冷冻电镜结构，从结构上定义了这种进化上独特的Topo II，并全面揭示了病毒Topo II调节DNA拓扑变化的结构基础。pP1192R表现出独特的抑制剂选择性，在具有代表性的Topo II毒物中，只有真核Topo II毒物m-AMSA通过靶向pP1192R对ASFV复制表现出明显的抑制活性。此外，m-AMSA捕获pP1192R-DNA复合物的结构揭示了m-AMSA对pP1192R的双重功能机制。研究揭示了pP1192R药物结合位点的详细结构信息，为设计Topo II特异性抗病毒药物开辟了新的途径。最后，研究人员提出了一种新的金属离子位置，它模拟了DNA预裂位点A2+的中间位置，为Topo II介导的亲核试剂的形成提供了更好的解释。该研究从结构上定义了pP1192R调制的DNA拓扑变化。pP1192R-DNA-m-AMSA复合体结构通过在预切割位点呈现A2+样金属离子，为Topo II介导的DNA切割中的经典双金属机制提供了支持，并更好地解释了亲核试剂的形成。

编辑 老Q

来源 iNature