【文献速递】双基因CRISPR敲除策略显著增强实体瘤CAR-T细胞治疗效果

研究亮点

来自宾夕法尼亚大学Perelman医学院的研究人员，探索验证了敲除Regnase-1和Roquin-1可提高T细胞的抗肿瘤功能。该成果发表在PNAS期刊，为设计实体瘤T细胞疗法提供了新视角，可将多重破坏炎症调节因子作为一种通用策略，以增强工程化CAR和TCR-T细胞的效应功能。

研究使用由Integrated DNA Technologies (IDT) 公司（中文简称“IDT埃德特”）提供的Alt-R sgRNA、电转增强子，以及Aldevron公司SpCas9核酸酶，Lonza电转仪，通过RNP递送方法实现了T细胞基因组高效率编辑。

研究发现，在健康供体的T细胞中，同时敲除炎症调节因子Regnase-1和Roquin-1能够显著提升工程化人类T细胞在实体瘤中的抗肿瘤活性。

虽然单独敲除任一基因即可观察到表型变化并改善体内反应，但双基因同时敲除能够带来更优的抗肿瘤效果，尤其是Regnase-1在过程中起到关键作用。

研究背景

近年来，T细胞疗法，尤其是嵌合抗原受体 (CAR) T细胞疗法，在血液肿瘤治疗中取得了显著疗效，因此FDA批准了多种针对B细胞恶性肿瘤（包括B-ALL、DLBCL和MM），的各种CD19和B细胞成熟抗原靶向疗法。然而，由于多种因素影响，T细胞疗法目前在实体瘤治疗中的进展相对缓慢，其中主要因素是由于实体瘤中T细胞在持续抗原暴露下功能会逐渐减弱，进而导致抗肿瘤效应反应降低，这种现象被称为T细胞衰竭，已被公认为该领域的一大挑战。

研究者正致力于界定、调节并最终逆转或预防T细胞衰竭，以提高T细胞疗法在实体瘤中的应用疗效。研究工作的关键目标是恢复实体瘤环境中的效应物反应。然而，特异性增强效应细胞功能例如细胞毒性、增殖能力和细胞因子分泌等，可以通过多种方式实现，并非所有方式都与衰竭直接相关。

研究方法

研究采用CRISPR-Cas9基因编辑技术，在具有两种不同免疫受体的健康供体T细胞中单独或共同敲除Regnase-1和Roquin-1基因。经设计验证后的sgRNA序列 (IDT)合成，与SpCas9核酸酶 (Aldevron)在室温下孵育10 min生成核糖核蛋白复合物 (RNP) 后用于多基因敲除实验。随后，将RNP复合物与电转增强子 (IDT)混合后，使用Lonza Nucleofector 4D电转仪进行电穿孔处理。

结 果

01

Regnase-1和Roquin-1双基因敲除可增强静息CAR细胞和TCR-T细胞的炎症特征

采用CRISPR-Cas9敲除CAR-T细胞和TCR-T细胞中的Regnase-1 (Reg1-KO) 、Roquin-1 (Roq1-KO) 或两者双敲除 (DKO) 。敲除Regnase-1和/或Roquin-1不影响mesoCAR-T细胞或NYESO TCR-T细胞在生产过程中的扩增速度和转导效率，且操作高效。相较于野生型，Reg1-KO和Roq1-KO单敲后CD4+ CD8+双阳细胞比例升高，DKO细胞中CD4+ CD8+双阳细胞比例更高（图1A）。DKO细胞ICOS表达增强，OX40表达未变，两者都是Regnase-1和Roquin-1的靶标（图1B）。CD25表达在Reg1-KO和DKO细胞中变化较大，尤其是在mesoCAR-T细胞中（图1C）。DKO细胞在未接触同源抗原时，产生更多Th1和炎性细胞因子，如IL2、IFNg、TNFa、IL6和GM-CSF（图1D）。DKO细胞具有最高数量的差异表达基因，尤其是上调基因，与炎症相关包括IL17F、 IRAK3、IL10和IL19（图1E）。RNA测序显示DKO细胞上调多种炎症基因，与Roq1-KO和模拟细胞有显著差异（图1F）。

图1. Regnase-1和Roquin-1双基因敲除改变静息T细胞的活化谱

02

Regnase-1和Roquin-1双基因敲除可增强抗肿瘤活性

将NSG小鼠皮下植入AsPC1细胞以形成肿瘤，并接受CAR-T细胞治疗（图2A ）。空白对照组 (Mock) CAR-T细胞治疗效果差，仅有1/26的小鼠肿瘤得到完全清除。双基因敲除 (DKO) CAR-T细胞治疗效果显著，超过92%的小鼠肿瘤被清除。单独敲除Regnase-1或Roquin-1的CAR-T细胞也提高了肿瘤清除率，分别为85%和59%（图2B ）。治疗后4周，所有敲除组CAR-T细胞增强了肿瘤控制并在外周血中扩增更多，尤其是DKO细胞（图2C和D）。外周血中的KO细胞主要是CD8+，而对照组少于20%的是CD8+（图2E ）。因此，与对照组CAR-T细胞相比，所有KO CAR-T细胞均延长了生存期，其中DKO和Roq1-KO CAR-T细胞在 0.5×106 CAR- T细胞剂量下表现出最大的生存期延长（图2F）。Reg1-KO和DKO组小鼠的死亡原因是T细胞过度增殖，而非肿瘤负荷。降低DKO CAR-T细胞剂量能有效减少扩增和毒性，同时保持较高的抗肿瘤效果。

图2. Regnase-1和Roquin-1双敲除可增强工程T细胞的抗肿瘤功能

03

Regnase-1和Roquin-1双基因敲除细胞保留了更强的效应特征

通过AsPC1异种移植模型研究Regnase-1和Roquin-1双基因敲除 (DKO) CAR-T细胞的特性发现，DKO CAR-T细胞在肿瘤中的积累显著高于模拟细胞，约高出两个数量级（图3B）。与模拟细胞相比，DKO细胞在脾脏中的积累也显著增加，约三个数量级（图3C）。DKO细胞在肿瘤和脾脏中显示出更高的CAR表达，尤其是Reg1-KO细胞。Reg1-KO细胞显示出较低的衰竭标志物 (PD1、TIM3、LAG3) 表达，而Roq1-KO细胞则表现出较高的ICOS表达，表明ICOS的增强表达与衰竭机制无关（图3D）。DKO细胞维持了更高比例的中心记忆T细胞亚群，这可能有助于保留其效应功能（图3E）。上述发现表明，双基因敲除的CAR-T细胞在抗肿瘤反应中具有更强的效应特征和持久性。

图3. Regnase-1基因敲除可增强体内积累和功能特征

04

Regnase-1和Roquin-1双基因敲除可增强功能持续性

为了进一步评估KO细胞的功能持续性，使用辐照K562-Meso细胞连续刺激mesoCAR-T细胞四次（图4A），发现DKO CAR-T细胞展现出更强的细胞毒性和细胞因子功能（图4B）。细胞内细胞因子染色还显示，连续再刺激后，CD4和CD8 DKO T细胞中的细胞因子 (IL2、IFNg、TNFa) 和效应分子 (CD107a、GrB) 功能增强（图4C）。在小鼠中进行的肿瘤再挑战实验显示，接受KO CAR-T细胞治疗的小鼠在21天后肿瘤负荷控制良好，而模拟CAR-T细胞治疗的小鼠肿瘤生长类似未处理小鼠（图4E-F）。再挑战后第21天，接受KO细胞治疗的小鼠外周血中CD4和CD8 T细胞数量增加，尤其是DKO CAR-T细胞治疗的小鼠（图4G和H ）。一些接受Reg1-KO和Roq1-KO CAR-T细胞治疗的小鼠在初次肿瘤挑战后21天和再挑战后21天维持了较高的T细胞水平（图4I）。

图4. Regnase-1和Roquin-1双基因敲除可增强功能持续性

小 结

综上所述，研究证实Regnase1和Roquin1以及T细胞炎症反应的其他调节因子是可以显著增强T细胞治疗的潜在靶点，并揭示了在实体瘤环境中增加抗肿瘤反应的重要策略，为肿瘤免疫治疗提供了新的可能性。Regnase1和Roquin1是在内源性环境中发挥预防过度炎症功能的重要基因，可通过永久性敲除或短暂敲除来进一步探究其功能和作用机制。进一步的研究可能为调节炎症以改善针对实体瘤的免疫细胞治疗反应的治疗策略提供更多证据。

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David Mai et al, Combined disruption of T cell inflammatory regulators Regnase-1 and Roquin-1 enhances antitumor activity of engineered human T cells, Proceedings of the National Academy of Sciences (2023). DOI: 10.1073/pnas.2218632120

关于IDT埃德特

Integrated DNA Technologies, Inc. (IDT埃德特) 是丹纳赫集团（Danaher Corporation，纽约证交所代码：DHR）生命科学平台旗下的一家运营公司。IDT埃德特致力于面向生命科学界开发、生产并销售核酸产品，为学术与商业研究、农业、医疗诊断和药物开发等领域提供支持。IDT埃德特 开发了多项针对基因组应用的专利技术，涵盖二代测序、CRISPR 基因组编辑、合成生物学、数字 PCR 以及 RNA 干扰。通过GMP服务，IDT埃德特生产的产品被科学家用于研究多种形式的癌症以及各类遗传性和传染性疾病。作为定制核酸生产领域的优秀厂商，IDT埃德特为超过 130,000 名生命科学研究人员提供服务。

IDT埃德特创立于1987年，其生产总部位于美国爱荷华州科拉维尔，并在美国加利福尼亚州圣地亚哥、美国北卡罗来纳州三角研究园、比利时鲁汶以及新加坡等地设有生产工厂。更多信息，请关注“IDT埃德特”微信公众号或访问www.idtdna.com。

关于Aldevron

Aldevron公司为丹纳赫集团（Danaher Corporation，纽约证交所代码：DHR）生命科学平台旗下子公司。1998年，Aldevron由Michael Chambers与John Ballantyne创立，总部位于美国北达科他州法戈 (Fargo, North Dakota) ，目前全球员工共计约600名。自成立以来，Aldevron一直以“惊人速度”成长，目前已成为一家专业研发、生产、销售的全球性创新生物产品供应商，提供高质量的质粒DNA、CRISPR基因组编辑相关核酸酶、蛋白质、抗体和其他生物制品。依托自有GMP生产设施，Aldevron产品等级涵盖用于基础研究的科研级别、用于临床试验和商业应用的cGMP-Source和cGMP级别。更多信息，请访问https://www.aldevron.com。