脑声常谈丨转棒实验评估帕金森病小鼠模型

6-OHDA单侧损伤模型

小鼠腹腔注射6%水合氯醛麻醉(350μg·g－1)。将动物固定在立体定位仪上，沿颅顶矢状缝切开皮肤，暴露前囟(Bregma)。在前囟前(AP)+0．5mm，中线旁(ML)－2．0mm(右侧)打孔。微量进样器(上海高鸽，10μL)缓慢下行，先后分别在颅骨下(DV)－3．0mm和－2．0mm各注入6-OHDA溶液0．78μL，速度0．5μL·min－1，每次注射完成后需留针3min。匀速退出进样器，缝合处理创面。

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鱼藤酮致帕金森模型

在整体动物水平上，目前有多种PD造模方法，6-羟基多巴胺（6-OHPA）模型、1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）模型、百草枯模型、转基因模型和鱼藤酮模型，但前几种模型都不能模拟Lewy的形成（PD的病理学标志），同时鱼藤酮诱导的PD小鼠模型能够很好模拟人类PD发病进程。

将适量鱼藤酮溶解在DMSO中，制得100mg/mL鱼藤酮储备液，再用橄榄油稀释成浓度为2mg/mL的工作液（工作液中含DMSO的浓度为2%）。将工作液均匀涂布在洁净的底面积为390cm2小鼠笼子的底面（鱼藤酮给药量为7.5mg/kg/d），用透明胶带密封盖子，保证鱼藤酮在鼠笼中的密封性，盖子左上角留一个通风小口，保证小鼠换气。正常组不做任何处理，溶剂组在笼子底面均匀涂布2%DMSO的橄榄油溶液。小鼠在充满鱼藤酮的环境中活动，充分地接触到鱼藤酮，持续3h，避光。持续给药40天，每天造模完毕，将小鼠放回到有垫料的笼子里，自由饮水，饮食量控制在4mg/只/天。

动物适应性观察一周后，称重。先随机分为3组：正常组、溶剂组（含2%DMSO的橄榄油溶液）和模型组（鱼藤酮橄榄油溶液）。各组动物按照上述方法处理，接触式给药40天后，进行行为学测试，造模不成功的动物剔除。将造模成功的动物再随机分为3组：模型组（给予鱼藤酮7.5mg/kg）、阳性药物组（给予7.5mg/kg鱼藤酮和120mg/kg美多芭）和PF治疗组（给予7.5mg/kg鱼藤酮和5mg/kgPF）。所有动物共计分为5组：正常组、溶剂组、模型组、阳性药物组和PF治疗组。第41~49天，鱼藤酮处理3h后，动物灌胃给药，一天一次。正常组、溶剂组、模型组灌胃无菌水，阳性药物组和PF治疗组分别灌胃给予美多芭和PF溶液。每日一次，持续给药9天。（美多芭配成7.2mg·mL-1溶液，按照120mg/kg即500μL/30g剂量灌胃；PF配成0.3mg·mL-1溶液，按照5mg/kg即500μL/30g剂量灌胃）。鱼藤酮造模第30天，小鼠出现自主活动减少、动作缓慢、震颤、立毛、竖尾等PD症状。

MPTP致帕金森模型

C57BL/6小鼠对MPTP敏感性强,造模时采用腹腔注射,避免经颅内给药造成颅脑损伤,操作简单,成功率高,是建立PD模型常用的动物。MPTP(30mg/kg)通过腹腔注射给药，给药时间为第1天到第5天，每日1次，对照组给予等量生理盐水。在腹腔注射MPTP后,发现C57BL/6小鼠出现体质量下降,弓背竖毛、尾僵直、行动迟缓、震颤等与PD类似的症状,表明造模成功。PD的主要表现是运动障碍症状,旷场实验、爬杆实验和转棒实验是目前检测小鼠运动协调行为的常用方法。由于MPTP具有神经毒性作用，使用过程中注意防护，使用过程中接触MPTP的物品需用消毒液浸泡失活后再进行处理。

转棒行为检测

转棒实验主要用来测量小鼠运动协调和平衡能力，转棒行为是动物一种被动行为检测方式，无需外源性药物刺激，可以较好反映模型的初始损伤情况，也可较好地衡量模型的损伤程度。

在正式实验前，首先，将小鼠放置于转速从 4 r/min 逐渐增加至 40 r/min 不停转动的疲劳转棒仪器中，并按照转棒旋转相反的方向进行为期4天的运动训练，每天训练2次，2次训练时间间隔30 min，以此作为疲劳恢复时间。每天逐渐增加训练时间，从第1天每次训练60 s到第4天每次训练180 s，在训练过程中，任何过早从转棒跌落到平台的小鼠都会被放回继续进行训练。训练结束后，筛选出能在40 r/min 转速的转棒上停留超过180 s的小鼠以进行后续试验，排除不达标小鼠。将所筛选出的达标小鼠进行随机分为对照组、模型组、给药组等。记录小鼠在转棒上的停留时间为跌落潜伏期。将分组后的小鼠分别置于转速为 40 r/min 的转棒上，测试在该转速下小鼠的跌落潜伏期，记录为T0。若小鼠的跌落潜伏期超过180 s，则按180 s 记录。每组分别给药，给药后每组再进行3次测试，每次测试时间间隔30min，记录小鼠给药后跌落潜伏期，分别记录为 T1、T2及 T3。根据 T1、T2及 T3较 T0变化的程度来分析用药对小鼠运动平衡能力和肌肉协调性的影响。统计结果以停留时间(s)表示。小鼠在转棒仪上的停留时间越长，说明小鼠四肢平和协调能力越好，反之，说明小鼠平衡协调能力越差。

指标分析：

• 潜伏期（latency）：它表示小鼠第一次掉落棒的时间，潜伏期越长，表明小鼠的运动协调能力越好。

• 均衡时间（balance time）：它表示小鼠能够保持在棒上的时间，这个指标通常用于测量小鼠在旋转速度逐渐增加时的运动协调能力，均衡时间越长，表明小鼠的运动协调能力越好。

• 转速（rotational speed）：棒的旋转速度，一般以每分钟旋转数（rpm）为单位。

• 转数（rotations）：小鼠在测试期间在棒上完成的完整转数

文献引用：

1.徐君怡. 加巴喷丁、度洛西汀与白藜芦醇联合用药镇痛效果评价[D].江苏海洋大学,2023.

2.左丽. 7.8-二羟基黄酮通过自噬改善MPTP诱导的帕金森模型鼠运动障碍的作用及机制研究[D].重庆医科大学,2023.

3.Neuronal autophagy and mitophagy in Parkinson's disease.[J]. Lizama Britney N;Chu Charleen T.Molecular aspects of medicine,2021

4.Metabolic homeostasis via BDNF and its receptors[J]. Podyma Brandon;Parekh Kavya;Güler Ali D.;Deppmann Christopher D..Trends in Endocrinology & Metabolism,2021

5.Parkinson's disease.[J]. Bloem Bastiaan R;Okun Michael S;Klein Christine.Lancet (London, England),2021

6.吴宿慧,史亚瑾,安迎凤,等.肉桂醛对MPTP诱导的亚急性帕金森模型小鼠的神经保护机制研究[J].中国中药杂志,2022,4 7(23):6485-6493.

7. Precision medicine in Parkinson's disease: emerging treatments for genetic Parkinson's disease.[J]. Schneider Susanne A;;Alcalay Roy N.Journal of neurology,2020

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