Cell Research | 卢培龙/刘磊团队合作报道镜像结合蛋白的精确从头设计

2024年8月14日，西湖大学卢培龙研究员实验室与清华大学刘磊教授实验室合作在Cell Research杂志发表了题为Accurate de novo design of heterochiral protein-protein interactions的研究论文。该研究成功建立了镜像蛋白的从头设计和定向进化体系（图1），实现了针对靶蛋白特定结构表位精确设计镜像结合蛋白。

镜像蛋白质多肽药物由D-氨基酸构成，作为一类非传统新型蛋白质多肽药物，在生物医学领域展现出巨大潜力。其主要优势包括：一、免疫原性低，因免疫系统无法识别D-氨基酸；二、口服给药和长效治疗潜力大，因体内蛋白酶无法降解D-肽键。虽然镜像噬菌体展示技术可用于筛选较大结构空间，但存在筛选范围受限和效率不高的问题。精准设计镜像蛋白质，使其与天然蛋白质特定结构表位形成高亲和力的相互作用，是镜像蛋白多肽药物研发的关键。

图1 镜像结合蛋白的从头设计和定向进化体系

在镜像结合蛋白的从头设计体系中，首先通过镜像翻转L型靶蛋白获取D型靶蛋白。随后针对D型靶蛋白的特定结构表位进行分子对接和相互作用界面设计，以设计出大量潜在的能与D型靶蛋白有效结合的L型结合蛋白。接下来构建L型结合蛋白库，并利用酵母展示技术进行高通量测试表征，鉴定出能与D型靶蛋白结合的L型结合蛋白序列。最后采用化学合成方法制备具有相同序列但手性相反的D型结合蛋白，进行结构和功能分析。

在本研究中，研究人员采用开发的从头设计框架针对三种靶蛋白进行了镜像结合蛋白设计，包括人工设计的α螺旋短肽、神经生长因子 （NGF） 的受体原肌球蛋白受体激酶A （TrkA） 、以及白细胞介素6 （IL-6） 。选择的结合表位分别为NGF与L-TrkA的结合面和IL-6受体与IL-6的结合面。针对这三种蛋白，研究人员合成了对应的D型蛋白，并成功进行了折叠复性，以确保它们具有与L型蛋白镜像对称的三维结构。通过高通量表征测试，研究人员分别鉴定了三种靶蛋白的高亲和力L型结合蛋白，亲和力范围约在20至150 nM之间。

研究人员通过化学合成制备了相应的D型结合蛋白并对其进行了表征。结果表明D型结合蛋白的二级结构与设计模型一致，并展现出与L型结合蛋白的镜像关系。这些蛋白具有出色的热稳定性——即使在95摄氏度时也能保持完整的二级结构。亲和力测定表明D型结合蛋白与相应的L型靶蛋白的结合力强，亲和力范围约在20至150 nM之间，与L型结合蛋白相当。

在蛋白酶降解实验中，L型结合蛋白可以被胰蛋白酶和胃蛋白酶完全降解；D型结合蛋白则能完全抵抗这两种蛋白酶的降解作用。这表明D型结合蛋白具有出色的抗蛋白酶降解特性，为未来的口服给药和长效治疗提供了理论基础。

研究人员对结合蛋白进行了定向进化，获得了亲和力增强至2至3 nM的变体。同时，研究人员在细胞层面对其功能进行了评估。结果显示，针对TrkA的D型结合蛋白可显著抑制NGF诱导的细胞增殖，EC50值约为120 nM。而针对IL-6的D型结合蛋白在细胞实验中能有效抑制IL-6激活的信号通路，EC50值约为1 nM。

图2 D型结合蛋白与L型α螺旋短肽复合物的晶体结构

此外，研究人员解析了D型结合蛋白与人工设计的L型α螺旋短肽复合物的晶体结构，解析分辨率为2.0 Å（图2）。结构分析显示，晶体结构与设计模型的主链碳原子RMSD仅为0.6 Å，且相互作用界面上的氨基酸构象与设计模型高度一致。这证明了该设计具有极高的精确度。该研究同时揭示了异手性α螺旋相互作用的独特结构基础，该模式与同手性α螺旋间相互作用显著不同。

综上所述，本研究成功实现了对特定空间结构表位的镜像结合蛋白的精确从头设计，并在结构、生化、细胞等多个维度上验证了其功能，为镜像蛋白多肽药物的开发奠定了坚实的基础。

西湖大学生命科学学院卢培龙研究员和清华大学化学系刘磊教授为共同通讯作者。西湖大学生命科学学院博士研究生孙科、博士后李思聪、博士后郑博闻、博士后朱雁磊以及清华大学化学系博士研究生王通越为本文的共同第一作者。

https://www.nature.com/articles/s41422-024-01014-2

制版人：十一

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