液体活检丨ctDNA阴性结果到底靠不靠谱？是否还要组织活检复测？

ctDNA检测阴性结果真假难辨，

ctDNA肿瘤分数（TF）能否破解难题？

太长不想读版：ctDNA正日益革新肿瘤治疗方式，但针对其阴性检测结果往往需要通过组织活检进行复核确认，这为实际临床操作带来了不小的挑战。ctDNA肿瘤分数（ctDNA TF），又称ctDNA肿瘤比例，即ctDNA在血浆cfDNA总量中的比例，通过ctDNA TF量化可以提高ctDNA检测阴性可信度：若ctDNA TF≥1%时检测结果为阴性，基本就等同于真阴性，这时可不再进行组织活检复测；但若ctDNA TF<1%时检测结果为阴性，这时候可能会存在假阴性的情况，推荐再进行组织活检复测。

ctDNA（循环肿瘤DNA）在临床肿瘤诊疗中的应用日益广泛，尽管其潜力巨大，但人们对其阴性结果的准确性仍存疑虑，难以分辨是真阴性还是假阴性。为了解释这一阴性结果，往往需要依赖再次组织活检来进一步验证ctDNA的检测结果。

▲ 临床ctDNA检测常规实践流程

当前，无论是监管机构还是各大指南共识，都建议对各种肿瘤类型的ctDNA阴性结果进行组织活检复测。1,2 然而，这一建议在实际临床操作中却面临着不小的挑战。

2024年6月3日，《Clin Cancer Res》发表的一项研究报告称，通过肿瘤分数（TF）对ctDNA进行算法量化可以提高区分真阴性结果和由于ctDNA脱落不足而导致的假阴性结果。3 该研究来自3家医疗机构的共同作者9人，其中7人来自全球知名癌症NGS伴随诊断公司Foundation Medicine（以下简称FMI），第一作者兼通讯作者则是美国纽约州西奈山伊坎医学院蒂施癌症研究所（TCI）胸肿瘤学中心临床研究副主任，国际液体活检学会（ISLB）主席Christian Rolfo博士。

▲ ctDNA TF量化有助于鉴别真阴性和假阴性结果

研究人员称，通过ctDNA TF量化可以显著提升ctDNA与组织活检在驱动基因检测的阳性符合率（PPA，灵敏度）和阴性预测值（NPV）。对于所有样本而言，这两项指标分别为63%和66%，但当ctDNA TF≥1%的样本时，阳性符合率高达98%，阴性预测值也攀升至97%，展现出更为精准的检测效能。这意味着若ctDNA TF≥1%时检测结果为阴性，基本就等同于真阴性，这时候进行组织活检复测的阳性率极低，再进行组织活检复测意义不是很大；但若ctDNA TF<1%时检测结果为阴性，这时候可能会存在假阴性的情况，推荐再进行组织活检复测。

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ctDNA肿瘤分数

临床基本概念

ctDNA，即循环肿瘤DNA，是150-200个碱基对的DNA片段，源自癌细胞，存在于血液或其他体液中。

cfDNA，即细胞游离DNA，是血液中的所有DNA，包括正常细胞DNA和肿瘤细胞DNA。ctDNA是cfDNA中专门源自肿瘤的那部分，但在ctDNA抽提和检测分析流程中，ctDNA和cfDNA无法被真正分离，所以ctDNA检测必须要关注ctDNA肿瘤分数。

ctDNA肿瘤分数（ctDNA Tumor Fraction，ctDNA TF），也称ctDNA肿瘤比例，是液体活检中真正肿瘤信号的生物标志物，它被定义为一个样本中肿瘤衍生ctDNA占总cfDNA的比例，并通过多种方法结合量化（包括非整倍体、变异等位基因频率和经典基因改变等）。我们可以将其简单理解成肿瘤组织中肿瘤纯度这一概念。

FMI研究人员对ctDNA TF算法进行了优化改进，使用了新技术来规避胚系突变（ 基于变异等位基因频率的胚系去除算法 ）和克隆性造血突变（ 基于外周血单核细胞测序鉴定的多组模式去除克隆性造血突变算法 ）信号干扰。

对于存在显著非整倍体的样本，纯度评估来自一个强大的拷贝数模型，该模型通过全基因组单核苷酸多态性（ SNP ）等位基因频率来确定ctDNA TF。如果不存在显著的非整倍体，则通过短变异等位基因频率和被认为可能是体细胞的重排来确定ctDNA TF。

▲ 基于非整倍体的肿瘤分数训练模型[4]

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ctDNA肿瘤分数

临床研究结果

研究人员评估了基于液体活检（F1LCDx）和组织活检（F1CDx）检测结果之间的一致性，通过ctDNA TF进行分层，并在真实世界中确定其临床研究结果。

▲ FMI F1LCDx vs. F1CDx

该研究共纳入3,854名进行过ctDNA和组织活检的癌症患者（血液采集在组织采集后进行），包括非小细胞肺癌（N=1,753）、乳腺癌（N=835）、结直肠癌（N=859）和胰腺癌（N=407），并对阳性符合率（PPA，灵敏度）、阴性预测值（PPV）和阴性符合率（NPA，特异性）进行比较。

研究结果显示，在所有样本中，ctDNA和组织活检对驱动基因检测的阳性符合率（PPA）和阴性预测值（NPV）从63%和66%提高到ctDNA TF≥1%样本的98%和97%，这表明当ctDNA TF≥1%时，血液ctDNA检测结果足够可信并可指导临床医生做出治疗决策。而ctDNA TF<1%时，阳性符合率（PPA）和阴性预测值（NPV）均不到50%，这表明当ctDNA TF<1%时，可能会出现假阴性结果，应再次进行组织活检复测。

▲ ctDNA TF鉴定液体活检与组织活检结果高度一致

同时，研究人员进行了一项回顾性分析，结果发现在505例ctDNA检测未发现驱动基因突变的肺癌患者中，随后进行了组织活检复测，发现有37%的患者携带有驱动基因突变（ctDNA TF<1%）。这更加确认了当ctDNA TF<1%时，可能会出现假阴性的情况，应再次进行组织活检复测。

▲ ctDNA TF<1%时，37%的ctDNA阴性但组织活检为阳性

随后，研究人员又重点分析了80例ctDNA TF对肺癌患者的分层情况，发现在ctDNA TF<1%的患者中，52%（29/56）经组织活检复测出驱动基因阳性；而在ctDNA TF≥1%的患者中，100%（24/24）经组织活检复测驱动基因均为阴性。这更加证实了ctDNA TF的临床作用及选择1%作为阈值的临床价值。

▲ ctDNA TF可指导否需要进行组织活检复测

基于此，研究者画了一个“区分可操作液体活检结果的临床范例”流程图，以期指导临床的靶向治疗。在ctDNA检测结果是阴性的情况下，通过ctDNA TF来确定是真阴性还是假阴性：ctDNA TF<1%的阴性是一个不确定的阴性，应进行组织复测；ctDNA TF≥1%的阴性基本能确定是阴性，可不进行组织复测。

▲ 区分可操作液体活检结果的临床范例

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ctDNA肿瘤分数

FMI报告展示

FMI的液体活检伴随诊断产品是F1LCDx，组织活检伴随诊断产品是F1CDx，这么多年FMI一直在探索如何准确判读ctDNA（阴性）检测结果。此次，随着《Clin Cancer Res》文章的发表，再次证实了ctDNA TF在判读ctDNA阴性结果方面的效能，FMI也第一时间在官网进行了更新，强调了ctDNA TF在ctDNA检测中的作用（F1LCDx报告中会将ctDNA TF信息作为一项专业服务进行报告）。5

F1LCDx是美国FDA批准的伴随诊断产品，可检测324基因，并报告311个基因。作为一项未经FDA审查或批准的实验室专业服务，F1LCDx还可以分析bTMB、MSI-H状态和肿瘤细胞分数（Tumor Fraction），并在报告中展示：

在这份报告中，在“BIOMARKER FINDINGS”（生物标志物发现）部分报告了Tumor Fraction（ctDNA肿瘤分数），结果是：Elevated Tumor Fraction（肿瘤分数升高），这就意味着ctDNA TF是≥1%的，并且ctDNA检测结果可信性更高。好在这是一份阳性报告，医生可直接根据报告内容给患者制定靶向治疗方案；如果这是一份阴性报告，也可以告诉医生这个结果就是真阴性，也可以启动标准的临床一线治疗方案了。

综合而言，该项研究已提供确凿证据，证实ctDNA TF可作为一种高灵敏度且特异性的技术，能有效评估血液中ctDNA水平和检测结果的准确性。ctDNA TF不仅能指导是否需要进一步的组织分子检测，还能在决定是否即时启动系统治疗时提供关键信息，既为可能获得重要诊断信息的患者保留深入检测的机会，又增强了为其他患者迅速启动治疗的信心。

参考资料：

1.Chakravarty D, Solit DB. Clinical cancer genomic profiling. Nat Rev Genet. 2021 Aug;22(8):483-501.

2.ctDNA高通量测序临床实践专家共识（2022年版）.中国癌症防治杂志，2022年6月第14卷第3期.

3.Rolfo CD, Madison RW, Pasquina LW, Brown DW, Huang Y, Hughes JD, Graf RP, Oxnard GR, Husain H. Measurement of ctDNA Tumor Fraction Identifies Informative Negative Liquid Biopsy Results and Informs Value of Tissue Confirmation. Clin Cancer Res. 2024 Jun 3;30(11):2452-2460.

4.Husain H , Pavlick DC , Fendler BJ , Madison RW , Decker B , Gjoerup O , et al .

Tumor fraction correlates with detection of actionable variants across >23,000 circulating tumor DNA samples. JCO Precis Oncol 2022:e2200261.

5.https://www.foundationmedicine.com/test/foundationone-liquid-cdx