上海交大团队改造蓝藻直接从二氧化碳生产紫杉醇前体

紫杉醇 (Taxol) 是应用最广泛的抗癌药物之一，它通过稳定微管形成将细胞周期停滞在 G2/M 期，从而阻止肿瘤细胞增殖，对乳腺癌、卵巢癌和肺癌有显著疗效。目前，紫杉醇的生产主要涉及三种方法：植物提取、化学/半化学合成和生物合成。几十年来，紫杉醇的经济生物合成一直是一个重大挑战。

紫杉醇的天然生物合成途径已被鉴定。第一步由紫杉二烯合酶 (TASY) 催化香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)环化，生成紫杉二烯（taxadiene）和异紫杉二烯（iso-taxadiene）。随后，紫杉二烯的三环结构在一系列细胞色素 P450 氧化酶和乙酰转移酶的作用下，在各个位点发生氧化和酰化。接下来，主要的含氧紫杉烷——紫杉二烯-5α-醇（Taxadiene-5α-ol，以下简称 T5α-ol）由紫杉烷-5α-羟化酶（CYP725A4，以下简称 T5αH）催化，在紫杉二烯（taxadiene）的 C5 位引入一个羟基，将双键从 C4(5) 转移到 C4(20)。同时，需要细胞色素 P450 还原酶 (CPR) 为催化反应提供两个 NADPH 衍生的电子。

随着合成生物学的进步，人们能够在各种微生物底盘中从头合成紫杉醇前体。截至目前，大肠杆菌中紫杉二烯的最高产量已达到 1g/L；大肠杆菌中总含氧紫杉烷（total oxygenated taxanes）的产量提高到了 570mg/L；在工程酿酒酵母中，T5α-ol 的最高滴度是 34mg/L，紫杉二烯 -5α- 基乙酸酯（taxadien-5α-yl-acetate）的最高滴度是 11mg/L。

与这些微生物相比，蓝藻具有培养成本低、生长迅速、能够利用二氧化碳作为碳源等优势。此外，蓝藻天然的 GGPP 库能够稳定供应二萜前体；蓝藻中光合电子传递链的存在确保了还原能力的再生，帮助 P450 维持高活性。最重要的是，真核 P450 成功整合到光合类囊体膜中，使蓝藻成为 P450 表达的宿主。综合以上条件，蓝藻非常适合生产萜类化合物。然而，目前尚未有关于蓝藻生物合成紫杉醇的研究。

（来源：Biotechnol Biofuels Bioprod）

近日，上海交通大学团队在Biotechnol Biofuels Bioprod期刊发表了题为“Engineering cyanobacteria as a new platform for producing taxol precursors directly from carbon dioxide”的论文，这项研究探索了将蓝藻模型菌株Synechocystissp. PCC 6803（以下简称 Syn6803）作为紫杉醇生物合成的新平台。上海交通大学生命科学技术学院马钢为文章通讯作者。

具体来说，研究人员设计了 Syn6803，使其具有模块化代谢途径，包括甲基赤藓糖醇磷酸途径酶（methylerythritol phosphate pathway enzymes）和紫杉醇生物合成酶（taxol biosynthetic enzymes），以生产 T5α-ol。最佳菌株 DIGT-P560 可产生高达 17.43mg/L 的含氧紫杉烷（oxygenated taxanes）和 4.32mg/L 的 T5α-ol。此外，对 DIGT-P560 的转录组分析表明，建立含氧紫杉烷通量可以提高工程菌株的光合电子传递效率和中心代谢，从而改善外源基因引入引起的代谢紊乱。这是首次证明能够在蓝藻中由CO2直接生产 T5α-ol。

在这一过程中，研究人员首先将紫杉醇生物合成的上游途径引入底盘菌株 Syn6803。

GGPP 通过 MEP 途径缩合而成，GGPP 合酶被认为是 GGPP 生产的限速酶。研究人员在 Syn6803 野生型菌株中共表达异源 GGPPS（ GGPP 合酶） 和 TASY（紫杉二烯合酶），以将代谢通量从 MEP 途径转向紫杉醇合成。

图丨能产生紫杉二烯的 Syn6803 菌株的构建示意图（来源：Biotechnol Biofuels Bioprod）

ggpps和tasy基因从质粒 pGB259 克隆出来，在强启动子 Pcpc560 下作为操纵子共过表达，并通过同源重组整合到 Syn6803 基因组的 psbA2 基因座 (slr1311) 中，创建出基础工程菌株 TAXA-GT。菌株 TAXA-GT 在摇瓶中培养 7 天后产生约 0.24mg/L 的紫杉二烯，而在野生型菌株中未检测到任何紫杉二烯的痕迹。

1- 脱氧木酮糖 -5- 磷酸合酶（DXS）一般被认为是各种宿主 MEP 途径的关键限速酶，而法呢基焦磷酸合酶（IspA）负责催化 IPP 和 DMAPP 缩合生成萜类化合物骨架分子法呢基二磷酸（FPP）。因此，研究人员将从大肠杆菌中克隆的 dxs 和 ispA 基因插入菌株 TAXA-GT 的 slr2030 和 slr2031 之间，生成菌株 DIGT。经过 7 天的培养，菌株 DIGT 积累了高达 0.96mg/L 的紫杉二烯，是菌株 TAXA-GT 产量的四倍。这表明DXS 和 IspA 的共同过表达增加了 MEP 途径的代谢通量，有利于紫杉二烯的生物合成。

接下来，研究人员利用高密度培养 (HDC) 系统来释放 Syn6803 菌株生产紫杉醇前体的潜力。结果显示，在 HDC 培养基中 TAXA-GT 菌株的紫杉二烯滴度为 1.48mg/L，DIGT 菌株的紫杉二烯滴度为 2.94mg/L，与摇瓶培养相比，分别提高了 5 倍和 2 倍。

研究人员在后续实验中采用高光照策略，并引入紫杉二烯的下游氧化途径。高光照策略能够在一定程度上弥补光合色素不足对光合作用的不利影响。

为了对下游途径的组合进行优化，研究人员在细胞环境中建立基于细胞色素 P450 的氧化，这也是改造微生物以生产紫杉醇的关键步骤。

此前以大肠杆菌作为生产菌株时，考虑到原核生物中缺乏内质网等区室化结构，对 T5αH 和 CPR 的 N 端结构域进行了改造，以确保它们在细胞质中正常发挥作用。在此背景下，研究人员将密码子优化的 T5αH 及其还原酶伙伴 CPR 整合到紫杉二烯生产底盘 DIGT 中，并实施模块化修改以提高下游含氧紫杉烷合成效率，包括 T5α-ol，从而产生菌株 DIGT-TLC。

通过比较这些菌株的含氧紫杉烷的总体生产力，具有“超强” Pcpc560 启动子的菌株 DIGT-P560 产生的总含氧紫杉烷滴度最高，为 17.43mg/L。相反，含有相对较低强度调节模块的菌株 DIGT-TC 产量最低，为 6.98 mg/L。总之，较高的 T5αH 表达水平可能对 Syn6803 中的紫杉二烯氧化产生有利影响。在翻译或转录水平上操纵 T5αH/CPR 组合的表达模式可以显著影响下游含氧产物的生产力和分布。

最终，优化的工程菌株 DIGT-P560 能够生产生产 17.43mg/L 含氧紫杉烷和 4.32mg/L T5α-ol。

总的来说，这项研究成功构建了光自养蓝藻中紫杉烷生产平台。鉴于该底盘中代谢网络的灵活性，将来有望进一步提高含氧紫杉烷的生产率。例如，诱导型启动子可能更适合异源细胞色素 P450s 酶，以减轻蓝藻光系统的代谢负担。

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