Nature Methods丨陈玲玲组利用CRISPR-dCas12系统实现非重复基因组位点和基因组位点多色标记

活细胞追踪DNA，RNA等核酸的空间分布和动态变化对于了解基因表达调控机制具有十分重要的意义。来源于细菌和古细菌体内的获得性免疫系统CRISPR-Cas系统由于其特异性靶向DNA/RNA的能力，已被广泛开发成多种细胞内DNA/RNA的遗传操作和检测标记的工具。

中国科学院分子细胞科学卓越创新中心（生物化学与细胞生物学研究所）陈玲玲研究组前期构建了基于CRISPR-dCas13的RNA标记系统，并实现了活细胞和斑马鱼胚胎内RNA的成像追踪以及活细胞RNA多色成像 (Yang et al., Mol Cell, 2019; Huang et al., Genome Bio, 2023; Yang et al., Cell Insight, 2022)。而靶向DNA的CRISPR-Cas9系统经改造后可用于活细胞DNA成像标记 (Chen et al., Cell, 2013; Ma et al., Nat Biotechnol, 2016)。这些CRISPR系统在标记内源核酸序列方面显示出其独特的优势，然而对于非重复DNA/RNA序列的活细胞特异性成像目前还存在着诸多限制。

近日，陈玲玲研究组在Nature Methods上发表了文章CRISPR array-mediated imaging of non-repetitive and multiplex genomic loci in living cells。 该研究对现有CRISPR-dCas12a系统进行筛选优化，构建了可用于非重复序列DNA活细胞成像的CRISPRdelight系统；进一步使用CRISPRdelight系统，揭示了基因位点在细胞核内定位与其运动能力和转录活性的相关性；同时利用RNA适配体修饰的CRISPR串联序列实现了对4种卫星DNA的活细胞多色成像。

CRISPR-Cas12a系统属于类型V的CRISPR-Cas家族，在靶向DNA的同时还具备将CRISPR串联序列加工成多条成熟crRNA的能力 （Zetsche, B. et al., Cell, 2015） 。因此CRISPR-Cas12a系统理论上可以通过CRISPR串联序列在同一细胞内表达足够数量crRNA从而实现非重复序列DNA的标记。

为了验证这一猜想，研究人员选取了已报导能显著提高基因编辑效率的三种dLbCas12a突变体，并对它们标记微卫星DNA Sat I和Sat III能力进行了比较，发现hyperdLbCas12a突变体 （D156R，D235R，D292R，D350R） 可以实现更高的标记效率和信号质量。研究人员进一步发现hyperdLbCas12a可以加工CRISPR串联序列并维持与直接表达成熟crRNA近似的DNA标记能力，同时筛选出了能够表达长达50次crRNA重复序列的CAG启动子，并基于此建立了用于活细胞DNA成像的CRISPRdelight系统。

研究人员针对CCAT1转录起始位点上游10kb的区域设计了48条gRNA，使用CRISPRdelight系统成功实现了CCAT1基因位点的活细胞标记。以同样的方式，CRISPRdelight系统在其他6个非重复序列基因位点均得到了有效验证，并且该系统在HCT116，U2OS以及小鼠胚胎干细胞 （R1） 中同样有效。CRISPRdelight系统相较于之前报道的基于CRISPR-dCas9的CARGO活细胞标记系统 （Gu, B. et al.，Science, 2018） ，具有质粒构建成本低、周期短、可表达gRNA数量多、标记系统组成更简洁等多方面优点。

研究人员利用CRISPRdelight系统进一步分析了CCAT1在细胞核内的分布特点和运动特征，发现位于细胞核膜处Lamin蛋白层的CCAT1位点运动能力明显弱于位于细胞核内的CCAT1位点，进一步检测CCAT1的内含子表达信号发现Lamin蛋白层的CCAT1位点转录活性也更弱。同时研究人员对HSPH1，HSPA1A等热休克基因进行了标记，在向细胞施加42°C或亚砷酸钠刺激后，发现定位于核斑的HSPH1基因位点会明显增多，并且位于核斑的基因位点转录活性也明显更强。这些结果表明了基因组DNA的细胞核内空间位置与其运动能力和表达活性的相关性。

最后，研究人员通过RNA结构优化，成功将BoxB、Pepper、PP7和MS2 等RNA适配子元件插入至gRNA中，利用CRISPRdelight系统和这些元件对应的融合荧光蛋白，实现了微卫星DNA Sat I、Sat II、Sat III和Sat α的活细胞四色标记（图 1）。CRISPRdelight系统为研究活细胞中DNA位点的空间位置和动力学特征，提供了更简单和便利的新手段。

图1. 使用CRISPRdelight同时标记多个基因组DNA位点

该研究工作主要由分子细胞卓越中心陈玲玲组杨良中博士 （已毕业） 、敏逸晖硕士、刘昱昕博士生共同完成，陈玲玲研究员为该论文的通讯作者。该项工作得到霍华德休斯医学研究所Zhe (James) Liu教授、复旦大学生物医学研究院/复旦大学附属儿科医院杨力研究员、清华大学王海峰博士的大力支持。

Graphical Abstract

专家点评

陈匡时（北京大学，研究员）

CRISPR/dCas9成像系统的发展使得对任意染色质位点进行成像成为可能。该系统利用失去切割活性的Cas9蛋白突变体 （dCas9） ，通过对dCas9进行荧光标记，或者改造single guide RNA (sgRNA)（如插入MS2、pepper等适配体） 使其能够被荧光标记，从而实现对目标染色质位点的成像。尽管CRISPR/dCas9体系是目前最广泛应用于活细胞基因组成像的系统，但其在多重检测 （multiplexing，即利用靶向不同序列的多个sgRNA标记同一个基因位点或多个基因位点） 方面存在一定的局限性。具体来说，利用CRISPR/dCas9进行多重检测通常需要构建多个带有不同sgRNA的质粒或慢病毒来实现多种sgRNA在同一个细胞中的同时转录。然而，这类方法可能导致不同细胞中sgRNA数量和种类的个体差异，从而影响对目标基因组在多个细胞中的高效检测。进一步研究显示，通过单一质粒转录多个sgRNA的方法，如CARGO体系，可以克服这一问题。然而，这类方法需要将多个sgRNA表达元件 （如U6-sgRNA转录单元） 引入同一个质粒中，合成步骤复杂且效率低。此外，多个启动子的同时存在还可能使得每个sgRNA的转录相互竞争，导致多个靶向的sgRNA无法同时存在，进而影响目标基因位点的高效标记。

为了发展更适用于多重检测的活细胞基因组成像工具，陈玲玲课题组基于来源于CRISPR系统V型的CRISPR-Cas12a (Cpf1) 体系，发展了一种名为CRISPRdelight的新型标记技术。与CRISPR-Cas9不同，CRISPR-Cas12a具备加工自身CRISPR RNA (crRNA) 的能力，而这一能力在去除CRISPR-Cas12a的DNA切割活性后仍然得以保留。课题组以hyperdLbCas12a这一变体作为CRISPR-delight的效应蛋白，并构建带有多个能与hyperdLbCas12a结合的crRNA的单一阵列RNA，证实了荧光标记的hyperdLbCas12a在单基因位点的检测灵敏度和标记效率方面，相较于基于CRISPR-dCas9的CARGO成像体系更具优势。此外，除了对hyperdLbCas12a进行荧光标记，课题组还证实了可以通过改造crRNA，使其含有不同种类的适配体 （包括MS2、PP7, Pepper和BoxB） 从而实现四色成像。

总体来说，CRISPRdelight技术不仅具备很高的拓展性，在多重检测方面也比基于CRISPR/dCas9的体系更有优势。通过进一步优化CRISPRdelight技术中的荧光团选择、crRNA结构以及Cas12a的脱靶效应等方面，有望使其成为推动三维基因组学、细胞生物学等研究领域发展的重要工具。

专家点评

马涵慧（上海科技大学，研究员）

人类基因组中含有 2万多个编码基因以及大量的非编码基因和调控元件。基因组DNA的三维结构与动态变化在基因转录调控、细胞分化、个体发育以及疾病发生过程中至关重要。用于研究基因组DNA三维结构的方法众多，比如基于高通量DNA测序的Hi-C、基于超分辨率显微镜的MERFISH等，目前已经积累了大量的数据用于分析和探索基因组DNA三维结构与功能的关系。但基因组DNA在活细胞中动态变化及其功能研究严重滞后，主要原因是缺乏一个高效、实时成像非重复序列DNA （包括基因或基因的调控元件） 的工具。美国国立卫生研究院资助的4D 核体计划 II期 （4D Nucleome Program） 把基因组实时动态变化和功能作为需要突破的重点内容之一。

基于CRISPR的活细胞DNA成像技术可以有效地示踪基因组中重复序列的动态变化，但是实时成像非重复序列DNA仍非常困难，主要的瓶颈在于其信噪比 （Signal-to-Noise Ratio） 低，亚细胞定位和长时间示踪都非常具有挑战性。因此这一领域研究人员一直致力于如何提高信号和降低噪音，期待实现高效、实时成像基因组DNA及其在基因调控过程中的动态变化。中国科学院分子细胞科学卓越中心的陈玲玲课题组和其合作者近期开发的CRISPRdelight，巧妙地解决的这一难题。

提高信号的方法主要通过增加特定区域内靶向位点的数量 （tiling array of gRNAs） 比如CARGO系统， 或对单个靶向位点的信号放大比如Casilio或CRISPR FISHer。这些系统都是基于CRISPR-dCas9，其中CARGO系统需要至少12个sgRNAs的阵列，每个sgRNA需要单独U6启动子控制转录，最后组装在一个质粒载体里，导致制备过程复杂，而每个sgRNA表达量的均一度也没法保证。CRISPRdelight是基于CRISPR-dCas12a，充分利用了Cas12a 可以处理来自CRISPR 阵列中单个转录本的多个sgRNAs，简化了sgRNA阵列的制备过程，保证了sgRNA阵列的均一性，极大地提高了基于CRISPR DNA成像的效率和灵敏度。

基因在细胞核内的定位和动态变化与基因转录活性和转录后加工的关系一直倍数关注。核斑 （Nuclear speckles） 和基因活性有关，富含大量RNA剪接因子，被认为参与剪接功能与调控。通过CRISPRdelight系统发现有内含子的基因在基因激活的时候会重定位到核斑表面，为基因转录与RNA剪辑的偶联机制提供了新的证据，暗示着通过DNA的重定位使新生pre-mRNA被运送（sorting）到剪切机器富集的核斑进行转录后加工。

通过与RNA适配体 （RNA aptamers） 结合，CRISPRdelight还可以成为多色系统用于同时观察多个DNA位点，为进一步研究DNA环相互作用 （DNA loop interactions） 比如增强子-启动子、增强子-增强子、启动子-启动子、启动子-终止子等相互作用及其功能奠定了良好的基础。进一步迭代CRISPRdelight多色系统，将来也可以在活细胞中示踪环挤压 （loop extrusion） 过程。鉴于其广泛的应用前景，CRISPRdelight系统将成为推动三维基因组学到四维基因组学 （时间为第四维度） 的有力工具之一。

https://www.nature.com/articles/s41592-024-02333-3