浙江
师弟最近在狂补 WB 结果，但面对 200 Kda 蛋白这座大山，结果图却一次比一次糊——「弥散、模糊、背景过高」没有一个图能用上。组会上师姐紧急支了 5 招：
师姐
一般来说，通过细致调整上述参数，可以有效改善 WB 转模糊的问题，提高实验结果的清晰度和特异性。
谢谢师姐，但是电压和抗体浓度我都做过梯度测试；凝胶没问题；试剂每次也都现配；封闭我也调整到 1.5 小时了，还是会糊。
师弟
我还有 2 块 96 孔板的样本，导师这个月就要结果，可怎么办呀？
师弟
师姐
如果还不行，我教你一条「WB 捷径」，凝胶扔了，也别转膜，用这个实验，30 个样本，5、6 个小时就出结果。
这是啥方法？师姐你快讲讲！
师弟
一种不提蛋白不转膜的 WB：In-Cell Western，顾名思义，是一种在细胞内就可以完成的简单 WB。比传统 WB 简单、快速、便捷。
01、更快、处理更多样本
传统 WB 通常需要 7～25 小时，最多一块胶跑 24 个样品，但 In-Cell Western 可以在 5～6 小时内完成最多 384 个样品。
02、ICW = WB + ELISA + IF
In-Cell Western（ICW）与传统 WB 方法不同，其使用固定和透化的细胞而不是细胞裂解物对蛋白质表达进行原位分析。并且可以使用光谱不同的荧光染料对多个目标进行定量，是一种确定大量样品中相对蛋白质水平的快速方法。
对于已经使用传统 WB 已经验证过抗体特异性且不需要考虑分子量的研究人员来说，ICW 是一种理想的实验方案选择。作为一种免疫荧光检测，ICW 结合了传统 WB 的特异性与免疫荧光、ELISA 的更高重现性及通量，可对 6～384 个孔的微孔板中生长的细胞中进行蛋白表达分析。
03、ICW 的大致实验流程
● 首先，对孔板中的细胞进行固定和透化处理，以允许抗体渗透进入细胞；
● 然后，用特异性一抗进行孵育结合，并使用不同荧光标记的二抗孵育，以实现多重检测；
● 洗掉未结合的抗体后，使用具有荧光功能的成像仪对微孔板进行成像，信号强度与细胞中存在的靶蛋白量成正比。
由于消除了传统 WB 方案中的样品制备、跑胶及转膜等步骤，ICW 需要的操作及实验时间更少。
04、ICW 的结果图长啥样？
通常的 ICW 的实验结果如下图：将 HEK293 细胞以 5k、10k、25k、50k、75k 和 100k 细胞/孔接种在重复的 column 中，靶蛋白为 Gamma（DyLight 680，红色）、p53（DyLight 800，绿色）和看家蛋白 GAPDH（罗丹明，灰色）。
最后，ICW 是一种多功能技术，可广泛应用于包括药物治疗或基因操作的蛋白质表达变化、评估蛋白-蛋白相互作用以及分析特定细胞区室中的蛋白质定位。ICW 还可用于筛选大型化合物库，了解化合物对蛋白质表达的影响，使其成为药物发现和开发的有效工具。
师弟
看到这我都心动了，结果图优化以及数据处理起来容易吗？
师姐
简单的。Bio-Rad ChemiDoc MP 全能型成像系统目前可申请免费试用点此申请，配合优化的 ICW 方案可以简化实验并优化效果。ChemiDoc MP 系统具有五个荧光通道，可实现三重荧光的 ICW 实验，并提供卓越的图像质量，配套的 ImageLab 软件也可方便地进行 ICW 的结果分析。快来点击下方图片链接申请吧～
注：
1. 相关产品仅限科研使用，不作为临床诊断。
2. Bio-Rad 是 Bio-Rad Laboratories, Inc. 在特定区域的商标
内容策划：潘成
内容审核：周育红
题图来源：视觉中国
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