国自然热点：可变剪切该如何研究

来源：青椒医学

一、可变剪切是什么？

可变剪切（Differential splicing），也叫选择性剪切（Alternative splicing），是真核生物基因表达调控中的一个重要环节，涉及到预 mRNA（前体信使 RNA）的加工过程。这一过程使得单一的基因能够产生多种蛋白质，极大地增加了蛋白质的多样性和细胞功能的复杂性。

以下是对可变剪切的概念、原理和机制的详细介绍：

概念

可变剪切是指在前体 mRNA 转录后的加工过程中，不同的剪切选择导致了不同的外显子（即编码蛋白质的基因片段）被包括或排除，形成多种成熟 mRNA 剪切异构体。这些不同的 mRNA 异构体最终被翻译成结构和功能不同的蛋白质。

原理

在基因转录过程中，基因的 DNA 序列被转录成前体 mRNA。前体 mRNA 包含编码序列（外显子）和非编码序列（内含子）。在成熟 mRNA 形成之前，内含子需要从前体 mRNA 中移除，而外显子则连接在一起。可变剪切涉及到在这个剪切过程中作出选择性的决策，即决定哪些外显子被保留或剔除。

机制

剪切体系: 剪切是由剪切体（spliceosome）完成的，剪切体是由多个小核糖核蛋白（snRNP）和其他蛋白质组成的复杂机器。这些组分协同作用，识别前体 mRNA 上的特定序列，执行剪切反应。

调控因子: 可变剪切的特异性由多种调控蛋白（如剪切增强子和剪切抑制子）控制，这些蛋白能够识别特定的序列并促进或抑制剪切的发生。

选择性剪切: 根据细胞类型、发展阶段或环境条件，剪切可以是选择性的，使得同一基因在不同情境下可以产生不同的蛋白质。

应用

可变剪切在许多生物学过程中扮演着关键角色，包括细胞分化、器官发育和疾病发生。对其机制的研究不仅有助于理解基因表达的复杂性，还可能对疾病治疗，特别是遗传性疾病和癌症的治疗提供新的策略。

这一领域的研究在不断进展，随着高通量测序和生物信息学技术的发展，科学家们能更深入地探索不同条件下的可变剪切模式，为疾病诊断和治疗提供更精确的生物标记和治疗靶点。

二、研究方法

可变剪切的研究涉及多种技术手段和检测指标，以解析其复杂的生化途径和调控机制。以下是一些关键的研究方法和技术：

1. RNA 测序 (RNA-seq)

RNA 测序是一种高通量的技术，可以在单次实验中从整个转录组中获取大量的读段。通过对这些读段进行比对和重建，研究者可以识别出大量的可变剪切事件，包括那些以前未被发现的新剪切形式。RNA-seq 数据可以用来分析可变剪切模式的变化，比如在不同组织、发育阶段或疾病状态下的差异。

2. 外显子芯片 (Exon Arrays)

外显子芯片是一种基于芯片的方法，设计有覆盖基因外显子的探针。通过分析芯片上的杂交信号，可以定量地检测特定外显子的包含与否，进而推断可能的剪切模式。尽管它的分辨率不如 RNA-seq，但外显子芯片仍然是分析特定条件下可变剪切事件的一个有用工具。

3. 核糖体剖面 (Ribosome Profiling)

核糖体剖面是一种先进的技术，通过测定核糖体保护的 mRNA 片段来确定哪些 mRNA 正在被翻译。这种方法可以用来检测因可变剪切而产生的不同蛋白质产物，从而更好地理解可变剪切在蛋白质层面的功能影响。

4. 生物信息学分析

随着高通量测序技术的普及，生物信息学在可变剪切分析中扮演着越来越重要的角色。使用专门的算法和软件（如 TopHat, SpliceSeq 等）可以从复杂的数据集中鉴定和量化剪切事件，同时预测剪切调控元件。

三、结果分析

下面我们来举 2 个例子带大家一键看懂可变剪切实验结果。

1. Minigene 实验显示 SRRM2 敲低改变 FES 和 SH3BP2 两个基因剪接模式（PMID：35929045，Nucleic Acids Research，中科院一区，IF：14.9）

这幅图显示了 SRRM2 敲除对 FES 和 SH3BP2 两个基因剪接模式的影响。实验使用了转染了对照（SCR）和 SRRM2 敲除（sh1、sh2）的 HEK293T 细胞，并通过 RT-PCR 来可视化微小基因的剪接模式。

如何分析这些凝胶图像：

a.识别条带：

每个凝胶图像显示了几个条带，这些条带代表不同的剪接变体。这些条带的强度和存在与样品间有所不同，表明剪接效率的差异以及形成的剪接变体类型的差异。

b.比较对照组和敲除样本：

FES 基因：

在对照组（SCR）中，可以看到两个明显的条带，表明有两个主要的剪接变体。在 SRRM2 敲除组（sh1、sh2）中，这两个条带的一个或两个强度有所减弱，这表明 SRRM2 的敲除影响了这些剪接变体的形成。

SH3BP2 基因：

对照组（SCR）同样展示了两个主要条带。SRRM2 敲除样本中这两个条带的模式改变了，特别是在 sh2 样本中，某些条带的强度明显改变，这可能表明剪接机制的显著变化。

2. CLIP-seq 显示 YBX1 导致多基因外显子跳跃的错误剪切。（PMID：36943004，Embo J，中科院一区，IF：11.4）

这张图展示了 CLIP-seq（Cross-linking and immunoprecipitation followed by sequencing）数据，用以分析 YBX1 蛋白与多个基因的 RNA 相互作用，以及这些相互作用如何影响外显子的剪切，特别是外显子跳跃（exon skipping）。

每个基因（Fn1-SE, Nrp2-SE, Sp7-SE, Sirt2-SE, 和 Spp1-SE）都有相应的图表：

蓝色条代表基因的编码区域，即外显子。

红色峰值表示 YBX1 蛋白在 RNA 上的结合位点，其强度反映了结合的密集程度。

分析方法：

识别重要区域：每张图中虚线区域表示外显子跳跃的位置

a.理解结合模式的影响：

通过比较有无 YBX1 结合的区域，可以推断 YBX1 结合的存在与否如何影响相邻外显子的包含或排除。例如，如果某个结合峰位于两个外显子之间的内含子上，YBX1 的存在可能促使这一区域的 RNA 不被剪切，从而导致外显子跳跃。

b.对比不同基因的响应：

观察不同基因如 Fn1 和 Spp1 在 YBX1 结合后剪接模式的变化。Spp1 的 CLIP 信号异常高，可能表明 YBX1 对该基因的剪接调控作用非常显著。

四、国自然中标统计

2023 年医学科学部「可变剪切」中标项目热度逐渐攀升

总而言之， 可变剪切作为一个在基因表达调控中极为关键的过程，其研究不仅增进了我们对生物多样性和细胞功能复杂性的理解，还为疾病诊断和治疗提供了新的视角和方法。通过不断发展的技术如 RNA-seq 和 CLIP-seq，科学家们能够更深入地探索可变剪切的机制和功能，发现新的生物标记和治疗靶点。随着高通量技术的进步和生物信息学的应用，可变剪切的研究正在迎来新的发展阶段，有望在未来在精准医疗和个性化治疗中发挥更大的作用。

2024 年度国自然医学部 50 大科研热点中标数统计如下：