斑马鱼行为篇㊻：斑马鱼模型在糖尿病研究中的应用

自1996年，研究者开始从分子、遗传及形态学等多个角度对斑马鱼胰腺进行研究。在胚胎早期发育中，斑马鱼胰腺经历两次发育分化过程。胰腺第一次发育出现于胚胎受精后24h(hours post-fertilization，hpf)，主要是形成一些分泌胰岛素的细胞，即为初级胰岛;5dpf(days post-fertilization)时，位于胰腺管内的前体细胞开始转化并聚集，形成次级胰岛，只有在第二次分化中形成的内分泌细胞具有增殖潜能，并形成后来成鱼的胰腺。与其他脊椎动物一样，斑马鱼胰腺的内分泌腺及外分泌腺均来源于内胚层。继内胚层分化及与中胚层分离之后，消化管前后轴的分化是胰腺发育的重要一步，这个过程直接伴随有多种信号途径的活化参与，包括Wnt、RA(retinoic acid)、BMP(bone morphogenetic protein)，FGF(fibroblast growth factor)和Hh(Hedgehog)等。斑马鱼胰腺结构简单，利用斑马鱼模型，可以在整体动物水平对糖尿病的病理现象及发病机制进行分析，并开展高通量药物筛选。

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斑马鱼糖尿病模型的应用基础及优势

硬骨鱼类体内分布有一些包含激素分泌细胞的内源性腺体，这些腺体分泌产生包括胰岛素在内的多种激素，用于机体的代谢调节，研究表明，这些腺体与人类的具有同源性。在斑马鱼，与代谢调控相关的主要器官，如胰腺，及一些对胰岛素敏感的外周组织组织肝脏、肌肉等在进化上具有保守性，一些与糖代谢调控相关的关键机制与其他哺乳动物非常相似，使得斑马鱼可以作为糖代谢调整控的研究模型，用于人类糖尿病研究。另外，对鱼类在碳水化合物利用方面的研究表明，如斑马鱼类生活在温水、杂食性的硬骨鱼对碳水化合物的利用度远高于生活在冷水、肉食性硬骨鱼，其糖代谢速度也比肉食性鱼类要快。碳水化合物是斑马鱼食物中的重要成分，斑马鱼生长速度与其含量成正比。一些与糖代谢有关的重要基因如己糖激酶、葡萄糖转运蛋白基因在斑马鱼体内活跃表达，而这些基因的缺失会引发斑马鱼胚胎发生一系列严重的神经缺陷，因此，糖代谢是斑马鱼机体代谢的重要组成部分，斑马鱼是进行糖尿病相关研究的理想模型。

由于基因组部分复制，斑马鱼的许多基因包含两个相应的直向同源基因，两个同源基因含的增强子不同，使其在不同的组织存在职能化表达。如胰腺的nkx2.2a、pax6b及jagged1b基因等即存在这一现象。利用斑马鱼基因表达的特点，现已构建了大量的斑马鱼突变体及转基因斑马鱼品系，如绿色荧光转基因斑马鱼，这种斑马鱼体内的器官或组织细胞能特异表达绿色荧光蛋白，加上斑马鱼幼鱼鱼体透明的特点，直接在显微镜下即可观察器官形态及组织成分的变化，可以有效的简化实验过程，非常适于药物的高通量筛选。

斑马鱼糖尿病模型的造模方法

糖尿病动物模型来源有两种，一种是由于动物自身基因的缺陷自发形成的糖尿病，另一种是通过药物诱导使动物发生糖尿病。药物诱导的啮齿类动物糖尿病模型是目前最常用的，常用药物有链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)和四氧嘧啶(alloxan)，两者均是通过烷化或诱导DNA破坏造成胰岛β细胞凋亡，造成胰岛素分泌量不足使血糖升高。啮齿类动物模型普遍存在成本高、周期长的缺点。

STZ易溶于水，但其水溶液在室温下极不稳定。Olsen研究中将STZ注入斑马鱼成鱼体内，斑马鱼出现血糖升高症状，而血液及胰腺中胰岛素含量显著降低。用同样方法建立了斑马鱼糖尿病模型，发现在去除STZ后2周内，斑马鱼胰腺β细胞完成再生修复，血糖恢复至正常水平。众所周知，糖尿病会引起伤口愈合困难，Michael实验中的糖尿病斑马鱼同样出现鳍再生及皮肤伤口的愈合障碍，而且，在血糖水平恢复正常后，这种现象仍持续存在，这与临床糖尿病表现是一致的，即一旦发生糖尿病后，即使通过药物干预将血糖控制到正常水平，但一些并发症会依然存在并继续进展。其他的多项实验也证明最初的高血糖阶段会造成靶器官出现持久的功能异常。这一现象被命名为“代谢记忆效应(metabolic memory，MM)”。Michael进一步对糖尿病高血糖期及血糖恢复后这两种状态下基因的表达情况进行研究，发现这两种状态下基因的表达模式发生了相似的改变，这也是血糖恢复正常后仍出现鳍及皮肤再生障碍的原因，即使血糖水平等指征恢复正常，高血糖对靶器官造成的损害仍无法逆转。

斑马鱼对环境中糖的摄取与渗透压调节有关，体内高渗状态使环境中的水分进入体内，葡萄糖随之摄入体内。利用高糖溶液浸泡法建立斑马鱼糖尿病模型，研究中将斑马鱼交替暴露于无葡萄糖的水与含2%葡萄糖的水溶液中，每24h更换一次，持续28d，会导致斑马鱼出现持续高血糖症状，在每次浸入2%葡萄糖溶液中时会重复出现血糖峰值。实验中将斑马鱼持续暴露于含糖溶液中，血糖也出现升高，但这种升高是短暂的，而且连续浸入糖溶液，尤其是高浓度糖溶液中，会导致斑马鱼出现游动及鳃功能异常，甚至出现死亡。

斑马鱼糖尿病模型的评价指标

血糖水平是反映胰腺β细胞功能的主要指标，也是临床糖尿病诊断或糖尿病动物模型研究中的常用检测指标。对麻醉后的斑马鱼成鱼取血，分别检测了斑马鱼空腹血糖(fasting)、餐后血糖(feeding)及糖负荷值(a glucose challenge)等指标，以研究斑马鱼体内的糖代谢规律。发现斑马鱼血糖处于动态地自我调节的状态。禁食2d时，血糖会出现应激性升高，第3天时即回落到正常水平。注射葡萄糖后30min内血糖水平升高并达到峰值，在6h时，血糖又重新回落到正常水平。在斑马鱼血糖检测中，麻醉方法是影响血糖值的一个因素，多数麻醉剂是神经细胞离子通道阻滞剂，会直接作用于β细胞通道影响胰岛素分泌。

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病常见的微血管并发症之一，是糖尿病人致盲的主要原因。斑马鱼的视觉系统与人类及其他哺乳动物的非常相似，在斑马鱼能够清楚的观察到整个视网膜细胞层结构，包括从神经节细胞层(ganglion cell layer)到视网膜色素上皮细胞层，因此斑马鱼被广泛用于视觉发育及修复研究中。糖尿病模型组斑马鱼内网层(inner plexiform layer，IPL)和内核层(inner nuclear layer，INL)均比正常组明显减少，IPL明显变薄，这与糖尿病患者及其他糖尿病动物模型中的视网膜病变表现一致。因此，斑马鱼视网膜形态的变化，可作为斑马鱼糖尿病模型研究中的一项观察指标。

参考文献：

1、Heritable Transmission of Diabetic Metabolic Memory in Zebrafish Correlates With DNA Hypomethylation and Aberrant Gene Expression[J]. Olsen, Ansgar S;Sarras, Michael P;Leontovich, Alexey;Intine, Robert V.Diabetes,2012(2)

2、Limb regeneration is impaired in an adult zebrafish model of diabetes mellitus[J]. Ansgar S.Olsen;Michael P.Sarras;Robert V.Intine.Wound Repair and Regeneration,2010(5)

3、劳乔聪.斑马鱼糖尿病模型的建立及在评价青钱柳功效中的应用研究[D].浙江农林大学,2018.

4、阮广聪.1,25(OH)_2D_3对INS-1细胞和斑马鱼糖尿病模型炎症反应的干预及其机制研究[D].苏州大学,2018.

5、Dynamic glucoregulation and mammalian-like responses to metabolic and developmental disruption in zebrafish[J]. Agata Jurczyk;;Nicole Roy;;Rabia Bajwa;;Philipp Gut;;Kathryn Lipson;;Chaoxing Yang;;Laurence Covassin;;Waldemar J. Racki;;Aldo A. Rossini;;Nancy Phillips;;Didier Y.R. Stainier;;Dale L. Greiner;;Michael A. Brehm;;Rita Bortell;;Philip diIorio.General and Comparative Endocrinology,2010(2)

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