浅谈眼科新药临床前药理毒理研究内容—附国内头部眼科技术平台介绍

随着人们寿命的增长，青光眼、白内障、年龄相关性黄斑变性（AMD）、视网膜静脉阻塞（RVO）等眼病已成为老年人主要眼睛疾患。而干眼病、过敏性结膜炎、糖尿病视网膜病变（DR）和糖尿病性黄斑水肿（DME）等眼科疾病则随着现代生活方式的改变而出现逐年增加的趋势。如何有效地预防和治疗这些疾病成为创新药物开发的主要方向。我国眼科新药的发展现状既包括新分子实体或新型生物制品，也包括已上市药物的适应症拓展和眼部新型制剂的开发和应用。眼表疾病和眼前节疾病给药方式以滴眼为主，而眼内及玻璃体注射（Intravitreal, IVT）则为眼底疾病的主要给药方式。目前国内尚未出台全面的眼部药物非临床安评指南，但已上市的眼部化药和生物药加起来超过20款，相关监管机构审评资料也逐步成为参考的重点。本文结合公开发表的文献，围绕眼科新药的非临床研究内容展开讨论。

先看下眼睛的结构，下图引自《眼部给药的非临床安全性评价实践与挑战》-孙云霞等，眼由眼球壁和内容物构成。眼球壁由三层组织构成，由角膜、巩膜构成外层，虹膜、睫状体和脉络膜（统称为葡萄膜）构成中层，内层为视网膜，其中有神经血管走行的视神经乳头和组织结构最薄的无血管、神经的黄斑区。眼内容物包括房水、晶状体和玻璃体，与角膜一起构成眼的屈光系统。其中晶状体是眼内重要的透明实体组织，它位于虹膜后、玻璃体前，被晶状体悬韧带固定于睫状体之间。晶状体之前的眼结构称为眼前段，约占眼球的1/3，由角膜、结膜、虹膜、睫状体、晶状体和房水组成；晶状体之后的眼结构为眼后段，约占眼球的2/3，由巩膜、脉络膜、视网膜及充满玻璃体液的玻璃体组成。

药效学研究

可以参考《眼科药物非临床研究的考虑》—戴学栋等。动物模型无法充分模拟人体，可以考虑采用多种模型组合验证药物的疗效。眼部用药药效学试验关键是选择合适的动物模型和药效学指标，证明药物在靶组织中达到有效治疗浓度。动物模型应关注与人体的相关性和局限性，包括：①动物眼部解剖和生理结构与人的相似性和差异性；②与人疾病的病理生理学的相似性和差异性，包括发病机制、疾病进程和临床表现等方面；③药物与人和动物靶点结合或占位的差异；④ 药物在动物和人体药代动力学方面的差异，如蛋白结合率、黑色素结合率差异等。选择的药效学指标应能够较好的测定及预测药物的疗效，尽量涵盖一些临床试验不能监测的指标，如病理学指标等。

药代动力学研究

给药后药物药代动力学及组织分布对于理解药物的安全性发现具有重要价值。药物在眼部组织、系统循环中的暴露量对于理解剂量间关系、给药方案、给药途经等也有重要意义。

局部外用：滴眼液通常以小分子化药为主，目标适应症多聚焦于眼前段（晶状体之前）相关疾病。药物滴眼后大部分药物并未进入角膜，而是从鼻泪管吸收，进入系统循环。少部分药物可以通过角膜上皮吸收。因此不同种属的角膜厚度对于药物的吸收速率和程度影响很大。不同种属角膜厚度如下图所示。

结膜-巩膜代表了另外一种吸收路径，对于亲水性的、分子量大的、角膜渗透性差的药物，主要经此路径吸收进入眼内组织。

结膜下给药：药物注射入结膜下腔后，经巩膜进入眼内组织，并经结膜血流或淋巴清除。比如泼尼松龙经家兔结膜下用药后，分布至角膜前区（1.7%）、角膜上皮（0.1%），一小部分进入房水和玻璃体（0.2%），剩余大部分进入系统循环。VEGF抗体Avastin经结膜下给药后，分布于虹膜睫状体和脉络膜-视网膜，但程度小于IVT给药。

玻璃体内和前房内注射：直接穿越眼部屏障将药物递送至前部或后部腔室，可以使药物直达靶组织，如视网膜和虹膜睫状体。

对于化药，不同种属体外代谢稳定性（肝微粒体、肝药酶等）和血浆蛋白结合数据需要在临床研究开始前提供。这点与系统给药的要求是类似的。

眼部小分子药物需要开展体外与黑色素的结合试验。如果有结合，PK和毒理研究种属需要考虑眼睛是否有色素。比如，白化鼠和家兔的视网膜色素细胞层就不明显。

眼部药物的药代动力学既要考虑系统暴露（如血浆、血清），也要考虑眼部组织的暴露水平（如角膜、结膜、巩膜、虹膜、睫状体、晶状体、玻璃体、视网膜、视神经和房水）。眼部样本很难进行连续采样，不同时间点样本通常来自不同个体。分析方法也是个挑战，因不同眼部组织对应不同的生物基质。对于生物药物，还要考虑游离药物、靶点结合药物等不同活性存在形式。比如VEGF抑制剂Eylea药物开发过程中，既检测了Eylea浓度，也检测了结合VEGF的Eylea浓度。玻璃体内，只有游离Eylea可以达到视网膜和脉络膜等作用位点，发挥药理学活性。而在外周，VEGF-Eylea才是长期存在的主要药物形式，对解释毒理学发现非常关键。因此眼部给药的生物药物要注意检测不同的活性形式。

安全药理学研究

根据ICH S7A，对于局部给药化合物如眼部，系统暴露量或药物分布至给药部位以外组织的量非常低，可以不开展安全药理学研究。不过，可以在重复给药毒性试验中伴随一些安全药理学终点的考察，比如ECG、动物行为等。比如Besivance、Bepreve这两款已上市的眼科药物，FDA在非临床审评综述中有提及，由于药物的系统暴露量非常低，单独的安全药理学研究是不必要的。

毒理学研究

由于没有特定支持眼科新药开发的非临床开发指导原则，眼科新药可以参考常规新药开发策略，遵从ICH M3、ICH S6等指南规定。

供试品：眼部毒性评价用供试品建议采用临床拟用相同制剂。给药浓度、给药频率至少与临床一致，或者超过临床拟用要求。理想的供试品应该无或者很弱的眼部刺激性。对药物的渗透压和pH也有一定要求，渗透压通常<500 mOsm，无刺激性的pH维持在4.3-8.4之间，无腐蚀性的pH则通常在2-11.5之间。这还是对于眼部外用的制剂，如果是前房内或者玻璃体内注射的制剂，考虑到虹膜-睫状体、晶状体、视网膜的敏感性、腔室体积狭小、玻璃体内流体循环缓慢等原因，对药物的限制因素更多，要求也更高，需确保充分的无菌和低热源。

试验种属：通常家兔、比格犬、食蟹猴是最常用的眼部毒性评价种属，主要原因是由于这几个种属眼睛大，方便眼部给药（尤其IVT注射）和眼部检查。而且，家兔和比格犬方便操作，不用麻醉即可实现眼部给药和检查。当然，毒理种属选择还要考虑黑色素结合、不同种属眼部解剖结构差异、生物药的种属间靶蛋白结合差异等。不同动物眼科给药的优缺点如下表所示，引自《眼部给药的非临床安全性评价实践与挑战》-孙云霞等。

按照ICH M3要求，重复给药毒性研究可以采用两个种属，啮齿+非啮齿类。但对于眼科药物，可以考虑在两种非啮齿类动物中开展。对于生物药物，如果只有一种相关种属，可以考虑仅在一个种属中进行。对于眼部毒性已经非常明确的药物，也可以考虑单种属。

由于眼部给药的产品通常系统暴露很低，无法充分评估对全身其它器官、组织的毒性。故，眼部用药通常会额外开展系统给药途经的毒理学研究，比如口服或静脉给药。眼科药物的系统给药途经毒性表征可以选择1种或2种种属，取决于：1）新分子实体（2种属）；2）已明确的毒性特点（1种属）；3）潜在低毒性（1或2种属）；4）眼部用药后系统暴露低（1种属）；5）仅有1个相关种属的生物药（1种属）。对于潜在低毒的产品，可以考虑短期重复给药毒性试验采用2个种属，更长周期则选择其中1个种属开展。

给药：动物试验给药途径通常与临床拟用途径一致。对于眼睛局部外用，临床常用体积是30-40μL，但人的眼睑裂隙通常只能保留25μL体积，其余则直接溢出或经鼻泪管流出。家兔、犬和非人灵长类滴眼通常给予30-40μL，可通过增加给药频率实现药物的充分暴露，甚至过度暴露。如临床BID，家兔可以给予TID或QID。比如BEPREVE（苯磺酸贝他斯汀滴眼液）开展的家兔、犬4周和13周毒理研究中，给药频率高达每天8次，而其临床拟用频率仅每天2次。家兔的IVT注射体积通常≤50 μL。眼房内注射体积更小，不到10 μL。有时甚至需要置换等量房水才能实现目标体积的注射。给药周期可参照ICH M3要求。

检测指标：临床观察、体重、摄食量、大动物心电图、血压、可能的免疫学指标（视药物作用机理）、毒代、临床病理和组织病理学检查（眼内、眼周和其它全身组织）。如果是生物药，还要监测抗药抗体。

除此以外，眼部新药需要开展详细的眼科相关检查。眼科的一般检查：用裂隙灯和检眼镜检查，检测内容包括眼睑、结膜、角膜、巩膜、前房、虹膜、瞳孔、晶状体、玻璃体及眼底。眼底检查主要观察视网膜的颜色，视神经乳头的形态、色泽、边界是否正常，视网膜血管走行和动静脉管径比例有无异常，观察视网膜有无水肿、渗出、出血、游离色素、萎缩、新生物和脱离等，黄斑中心凹反射及其附近有无水肿、渗出物、出血等。眼压：用眼压计测量给药后不同时间点药物对眼压的影响。光学相干断层扫描（OCT）：给药后通过OCT 检查眼内各结构是否出现异常，特别是眼底视网膜、脉络膜，并获得眼底OCT 图像。全视野视网膜电图（ERG）：通过ERG 检查，观察给药后药物对视网膜功能的影响，ERG 检测项目及流程参考国际临床视觉电生理协会（ISCEV）或所对应动物种属的ERG 操作指南，分析指标至少包括a波、b 波，在暗适应ERG 检测前，动物应至少要在暗室中适应30 min；明适应ERG检测前，动物则至少要先在明室中适应10 min。荧光造影（FFA）和眼底照相：检查各时间点眼底的结构，检查血管形态，是否有新生血管等异常反应。

其它毒性如遗传毒、生殖毒通常也需要开展。体内研究可以考虑采用系统暴露给药途径进行。根据ICH S1A，除非有特别担忧或有明显的系统暴露，眼部用药的产品通常不需要开展致癌性试验，但需要向FDA递交豁免的证据权重分析，并经FDA同意。

眼部用药和系统给药IND研究的药理毒理内容区别

案例一： Faricimab

Faricimab 商品名 Vabysmo ，是由 Genentech 开发，临床拟用于 neovascular (wet) age-related macular degeneration (nAMD), diabetic macular edema (DME), diabetic retinopathy (DR) 的 VEGF-A 和 Ang-2 双靶点 IgG1 抗体，结构示意图如下图所示，采用的 CrossMab 结构设计。其中，结合 VEGF 部分的抗体序列采用的已上市抗体 Lucentis 。 Fc 部分进行了改造，以消除与 Fc 受体的结合。临床给药方案是 IVT 注射， 6mg 剂量，前 4 次给药每 4 周一次，之后每 16 周一次。属于治疗用生物制品 1 类。

完成的非临床研究内容如下：

药效学

1）与人VEGF-A、Ang-2、Ang-1及Fc受体亲和力研究；

2）与不同种属Ang-2亲和力研究；（VEGF端采用的已上市Lucentis，已有充分研究）

3）小鼠脉络膜新生血管自发模型药效学研究；

4）食蟹猴激光诱导脉络膜新生血管模型药效学研究；

5）体外人补体激活试验；

安全药理学研究

未单独开展，伴随食蟹猴长毒进行神经、心率、血压、EKG等检查。

药代动力学

1）新西兰兔IVT和IV给药PK研究（单次、多次；玻璃体、房水及血清浓度）；

2）食蟹猴IVT和IV给药PK研究（单次、多次；玻璃体、房水及血清浓度）；

毒理学研究

1）食蟹猴2个月IVT和IV重复给药毒理研究；（支持IND）

2）食蟹猴2周IVT和IV给药耐受性试验；（支持IND）

3）食蟹猴26周IVT重复给药毒理研究；（支持BLA）

4）荷兰兔2周IVT和IV给药耐受性试验；（支持IND）

5）食蟹猴胚胎-胎仔发育毒性试验；（支持BLA）

6）致癌性试验文献资料；

其它研究

1）正常人体组织交叉反应试验；

2）体外人全血细胞因子释放及免疫细胞耗竭研究；

案例二： Netarsudil mesylate

Netarsudil mesylate 商品名 Rhopressa ，由 Aerie Pharmaceuticals 公司开发，临床拟用于开角型青光眼或高眼压患者，降低升高的眼内压。每天 1 次，每次 1 滴，滴眼给药。 Netarsudil mesylate 是 Rho 激酶抑制剂，其活性代谢产物 AR-13503 活性更强，是原型药的 5 倍。本品属于化药 1 类新药。

开展的非临床研究内容如下：

主要药效学

1）原型药及活性代谢产物对ROCK1、ROCK2等激酶抑制作用研究；

2）对食蟹猴眼部房水动态变化影响研究；

3）荷兰兔的有效性和耐受性研究（不同制剂间比较）；

4）不同浓度制剂在猴中的有效性和耐受性研究；

5）临床拟用制剂在猴中的剂量效应关系研究；

6）体外对Trabecular Meshwork Cells骨架成分影响；

7）Effects on Aqueous Flow Pattern and Morphology in Enucleated Eyes;

8）对荷兰兔巩膜浅层静脉压的影响；

次要药效学

1）对人蛋白激酶谱作用；

2）对非激酶谱的选择性；

安全药理学

1）hERG影响；

2）遥测系统检测对清醒比格犬心血管功能影响；

药代动力学

1）体外多种属肝提取物、肝微粒体代谢研究；

2）与人、比格犬、大鼠血浆蛋白结合试验；

3）体外与黑色素结合试验；

4）荷兰兔单次眼部用药后眼部组织分布研究（基于放射性标记）；

5） Long-evans大鼠静脉给药后物料平衡及QWBA研究（基于放射性标记）；

6）新西兰兔眼睛局部给药后房水中原型药及活性代谢产物浓度检测；

单次给药毒理学研究

1）大鼠静脉给药单次给药毒性试验；

2）比格犬静脉给药单次给药剂量爬升研究；

重复给药毒理学研究

1）荷兰兔7天眼部给药毒理研究；

2）食蟹猴7天眼部给药毒理研究；

3）荷兰兔28天眼部给药毒理研究；

4）食蟹猴1个月眼部给药毒理研究；

5）食蟹猴9个月眼部给药毒理研究；

6）荷兰兔3/6个月眼部给药毒理研究；

7）大鼠7天静脉给药毒理研究；

8）比格犬7天静脉给药毒理研究；

9）大鼠28天静脉给药毒理研究；

10）比格犬28天静脉给药毒理研究；

遗传毒性研究

1）细菌回复突变试验；

2）体外染色体畸变试验；

3）大鼠7天静脉给药微核试验；

生殖毒性研究

1）大鼠静脉给药胚胎-胎仔发育毒性研究；

2）兔静脉给药胚胎-胎仔发育毒性研究；

致癌性试验

未开展，提供了证据权重分析，如外周暴露少，长周期重复给药毒性研究未见癌前病变等。

其他案例（3个小分子+2个化药）

眼科药物非临床评价需要非常专业且价值不菲的高端设备，也需要极其专业且经验丰富的专家团队。不同于系统给药一般毒理研究中的眼科检查，眼科药物通常局部给药并在局部发挥作用，从给药方式到详细的眼部指标（裂隙灯和检眼镜检查、眼压、OCT、ERG等）表征都非常讲究。而且，很多眼科药物的药效、PK和毒理均在同一家机构，且在GLP条件下完成，国内应该有不少具备眼科药物研究经验的团队，本文推荐一个国内非常优秀的非临床研究机构—成都华西海圻，相信很多业内同行已经非常熟悉，已上市的康弘药业的康柏西普、齐鲁制药的阿柏西普生物类似药均由华西海圻完成，附该机构的眼科药物研究经验、团队、技术优势和服务体系，有需要可自行对接。

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