斑马鱼行为篇㊲：斑马鱼在环境毒理学测试中应用

在毒理学研究中，斑马鱼可用于判断受试物对斑马鱼各发育阶段的急性和慢性致死、致畸毒性；判断受试物质对斑马鱼各发育阶段相关基因和蛋白的表达变化；判断受试物质对斑马鱼世代繁殖和性别分化的影响；对化学物质的遗传毒性作出风险评价；斑马鱼是一种重要的模式生物，尤其在环境毒理学的研究中可以较好的反映受试物的环境毒性效应。

斑马鱼在环境毒理学中的试验方法

从斑马鱼整个生长周期上，可以将出生后的斑马鱼区分为胚胎期(0～3d)、卵黄囊期(4～7d)、幼鱼期(7～23d)以及随后的正常生长期。出生120d后的斑马鱼可视为性成熟成鱼，可以用于交配产卵。根据斑马鱼不同生长期的划分，可以开展不同时期的暴露试验。如可以在斑马鱼的各个时期开展3d的短期暴露试验，也可以在胚胎期之后的各个时期开展7d的短期暴露试验。通过短期暴露试验，获得受试物的短期急性半致死浓度，从而为长期的暴露试验的受试浓度奠定基础。短期的胚胎或者幼鱼期实验被广泛应用于大量的毒理学初步评价中，一般胚胎期的常用的观察终点有为卵凝结、体节形成、尾部延展、心跳、色素沉着、孵化率、畸形率等。计算各个时期的半数致死剂量则是评价和比较受试物毒性的重要指标。

胚胎期的斑马鱼由于外膜屏障保护，可以隔离一些体外环境中的外源物质，而出膜后的斑马鱼直接接触外界受试物，因此在早期的斑马鱼毒性试验中，胚胎期的耐受量可能略高于卵黄囊期，同时成鱼期耐受量一般也高于胚胎期、卵黄囊期和幼鱼期，因此在斑马鱼的急性毒性试验中需要根据受试物的特点和研究要求，开展不同时期的毒性评价。如在三氯生对斑马鱼毒性的研究中就分别探讨了三氯生对出生后144h内的斑马鱼胚胎和卵黄囊期以及成鱼期的毒性效应。在长期慢性暴露实验中，一般从胚胎期开始持续暴露至成鱼期(出生后120～160d)，根据研究需要，可以将暴露后的成鱼与未暴露过的同龄鱼相互交配产卵，从而获得长期暴露条件下受试物对子代的影响，考察指标一般为产卵量、成活率、性别分化等。由于在长期的暴露试验中，需要保证整个暴露期胚胎、幼鱼和成鱼的存活率，因此长期暴露试验中受试物的最高浓度一般不高于短期暴露实验EC50的10%。同时由于受试物的环境检出量也较低，因此在研究受试物的环境效应时可以选择受试物的环境检出量作为长期暴露实验的选择剂量。虽然长期暴露试验耗费的人力、物力资源远远高于短期的急性暴露试验，但获得的结果可以较好的反映受试物的环境效应。

斑马鱼的环境毒理学中检测指标

在斑马鱼的研究中，常用的检测指标除了上文中提到的卵凝结、体节形成、尾部延展、心跳、色素沉着、孵化率、畸形率、成活率等。在后续的研究中还包括激素水平、基因水平、蛋白水平等方面的研究。在环境毒理学中，受试物对斑马鱼的内分泌干扰效应是该类研究中的重要内容。卵黄蛋白原(VTG)是卵黄的前体，一般在雌鱼的肝脏中合成，它是特定的雌激素类似物，可以通过结合到雌激素受体后刺激产生卵黄蛋白原。由于卵黄蛋白原基因是比卵黄蛋白原蛋白更灵敏的一种生物标志物，因此通过卵黄蛋白原基因vtg1在雄鱼肝脏中的表达量检测是评价环境中内分泌干扰物雌激素效应的常用方法之一。此外，鱼类的生殖能力一般受下丘脑－垂体－性腺轴(HPG轴)和肝脏的调控，其配子发育和卵母细胞的成熟均受到雌二醇和睾酮调控作用。HPG轴是一种新型的分析模型，它被用于内分泌干扰物的生态毒理基因组学和类固醇激素合成基因对性腺组织生殖力影响的研究中。从理论上讲，外源物质对HPG轴的任何损伤均会对生殖能力产生不良效应。因此通过研究斑马鱼体内雄激素和雌激素含量的变化，以及不同激素通路中重要基因表达量的变化是这样工作常用的研究方法。由于单独斑马鱼的血液较少，一般采用尾静脉采血，并使用专用的Elisa试剂盒测定斑马鱼的激素。由于可用于斑马鱼测定Elisa试剂盒的种类较少，而且研究成本也较高，因此测定相应激素和蛋白的特定基因表达量的变化在斑马鱼研究中使用较广泛。如可以通过提取下丘脑、垂体、性腺等组织的基因，采用实时定量PCR的方法来测定相关的激素基因。常用的激素基因包括激素受体类基因、促性腺激素释放激素(GnRHs)类基因、芳香族CYP类基因。GnRHs是一类通过HPG轴从而控制生殖能力的重要激素，它通过调节促性腺激素释放激素合成和释放从而产生相应的作用，对应的是gnrh类的基因。促黄体生成激素(LH)和卵泡刺激素(FSH)，与之对应的fshβ和lhβ基因在调节类固醇生成基因表达和激素依赖的反馈中发挥着关键作用，脑组织中fshβ基因的上调预示着相关化学物可以干扰精子的发育。芳香族的cyp19b基因具有自动调节脑组织雌二醇刺激的反馈作用，同时cyp19b基因的上调也可能导致成鱼体内雌二醇的水平的上升。芳香族的cyp19a基因具有催化雄激素向雌激素转化的作用，而上调的cyp19a则会干扰体内的激素平衡。CYP11A1是调节胆固醇转化为孕酮的蛋白酶，cyp17基因则在斑马鱼精巢17α-羟孕酮转化为雄烯二酮过程中发挥着重要的调节作用。此外，雌鱼和雄鱼的激素合成与类固醇激素合成急性调节蛋白(StAR)调节有关，该蛋白的mRNA主要控制激素基因的相关应答机制。这方面的研究也见诸于大量的研究工作中。

参考文献：

1、Effects of non-steroidal anti-inflammatory drugs on hormones and genes of the hypothalamic-pituitary-gonad axis, and reproduction of zebrafish[J]. Kyunghee Ji;;Xiaoshan Liu;;Saeram Lee;;Sungeun Kang;;Younglim Kho;;John P. Giesy;;Kyungho Choi.Journal of Hazardous Materials,2013

2、施嘉琛,郑婷婷,李红.模式动物斑马鱼在环境毒理学中的实验方法和检测指标[J].首都公共卫生,2017,11(01):38-40.

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