皮肤类器官培育新法：纺锤形态提升生存率，助力再生医学

文章介绍

2024年3月7日，美国研究团队在期刊Advanced Healthcare Materials（IF:9.9995）发表了一篇题为“Efficient Generation of Skin Organoids from Pluripotent Cells via Defined Extracellular Matrix Cues and Morphogen Gradients in a Spindle-Shaped Microfluidic Device”的文章。

#1

摘要

Abstract

本研究建立了一种在化学定义的3D细胞外基质（ECM）环境中有效生成多功能干细胞衍生的皮肤类器官（PSOs）的方法。实验发现，在胶原蛋白I（COLI）和层粘连蛋白511（LAM511）的补充下，PSOs生长更快，但无法完全分化。随后，研究人员使用3D生物打印的纺锤形水凝胶装置来约束类器官纵向生长，显著减少了坏死，提高了角质形成细胞的分化并增加了毛囊的形成。最后，将系统改造成微流控装置，以创建不对称的分化因子梯度，改善了真皮和表皮细胞的空间组织。研究强调了ECM和形态发生梯度在促进和空间控制PSOs框架中皮肤分化中的关键作用。

#2

研究方法

Methods

1.形成胚胎体（EB）：首先，使用小鼠胚胎干细胞（mESCs）形成胚胎体（EB）。

2. 嵌入三维水凝胶：在EB呈现明显边界时，将它们嵌入含有各种细胞外基质（ECM）的三维水凝胶中，而不是像以前的方法那样将EB在培养基中自由漂浮。

3. 诱导分化：在同一天，使用BMP4和SB诱导外胚层分化，使用FGF2和LDN诱导颅神经嵴分化，这与先前发表的方法类似。

4. 使用胶原I作为三维骨架：由于胶原I是主要的皮肤ECM成分，研究团队决定将胶原I作为三维骨架的一部分。

5. 微流控设备培养：将这些EB在一个类似纺锤形状的微流控设备中培养，利用定义的细胞外基质信号和形态因子梯度，促进皮肤器官样体（PSOs）的高效生成。

6. 评估PSOs的生长和分化：通过观察PSOs的形态学特征、细胞类型组成和功能特性等方面来评估其生长和分化情况。

7. 统计分析：使用统计学方法对实验数据进行分析，以评估不同样本组之间的差异。

通过这些方法，研究团队成功地实现了从多能干细胞中高效生成皮肤器官样体的目标，并为未来皮肤发育模型的研究提供了重要的方法学基础。

#3

主要结果

Results

3D水凝胶ECM促进皮肤类器官（PSOs）的早期分化

这项研究表明，3D水凝胶细胞外基质（ECM）对于促进多潜能干细胞衍生的皮肤类器官（PSOs）的早期分化至关重要。通过将胚状体（EBs）嵌入含有不同ECM成分（如胶原蛋白I）的3D水凝胶中，研究人员诱导了外胚层分化和颅神经嵴分化。在水凝胶环境中提供特定的成分增强了EBs向表皮祖细胞的分化，表明ECM相互作用在指导胚胎干细胞空间分化中的重要性。这种方法不仅促进了早期分化，还以特定于ECM类型的方式影响了PSOs的生长和发育。例如，在胶原蛋白I和层粘连蛋白511水凝胶中生成的PSOs相比于悬浮培养或其他ECM环境中的PSOs具有更强的生长能力，这强调了ECM组成对PSOs发育的影响。这表明ECM提供的微环境在指导PSOs的分化和生长中起着重要作用，最终有助于成功生成具有所需特性的皮肤类器官。

在ECM中嵌入生成的PSOs促进了生长，但未能完成皮肤分化

研究发现，将多功能干细胞衍生的皮肤类器官（PSOs）嵌入细胞外基质（ECM）中可以促进其生长，但未能实现完全的皮肤分化。尽管在多种ECM环境中培养的PSOs相比悬浮培养显示出了生长优势，这表明ECM成分对支持类器官发育的重要性，但实现完全皮肤分化仍存在局限性。特别是，在补充了层粘连蛋白511（LAM511）的胶原蛋白I（COL I）中生成的PSOs虽然生长增加，但未能诱导完全的皮肤分化，部分原因可能是坏死。为了解决这个问题，研究中使用了3D生物打印的纺锤形水凝胶装置，该装置纵向限制了类器官的生长并显著减少了坏死。与仅使用ECM嵌入培养相比，纺锤形装置中的培养系统导致角质细胞分化增加两倍，毛囊形成增加八倍，这表明皮肤分化达到了更高级的阶段。总的来说，尽管ECM嵌入的PSOs生成促进了生长，但研究中还需要采用其他策略，如使用专用的培养装置，以实现更高级和完全的皮肤分化。

在纺锤形几何结构的3D细胞外基质（ECM）中生成PSOs减轻了坏死

研究表明，在纺锤形几何结构的3D细胞外基质（ECM）环境中通过多功能干细胞衍生的皮肤类器官（PSOs），有助于减轻坏死现象，这是大型类器官系统中常见的问题。没有边界限制的球形类器官生长过程中，由于中心细胞营养供应受限，会出现坏死核心。通过将PSOs培养在纺锤形几何结构中，而不是球形结构中，能够缓解营养传输问题和随后的细胞死亡。使用氧气作为模型分子的数值模拟显示，纺锤形PSOs保持了比球形PSOs更高的氧气浓度，从而防止了类器官核心出现危及生命的低氧水平。纺锤形几何结构对ECM中嵌入的PSOs施加的空间限制，有助于在整个类器官中维持足够的营养和氧气水平，减少坏死，提高类器官的整体存活率和功能。因此，在3D ECM中培养PSOs时使用纺锤形几何结构是一种有效的策略，有助于减轻坏死，提高类器官的整体健康和存活率，从而有助于更成功和功能性更强的皮肤类器官生成。

纺锤形几何结构下嵌入细胞外基质（ECM）的PSOs增强了皮肤分化和毛囊形成

研究表明，将纺锤形几何结构的多功能干细胞衍生的皮肤类器官（PSOs）嵌入细胞外基质（ECM）中培养，可以增强皮肤分化和促进毛囊形成。与常规培养条件相比，使用纺锤形培养方法在COL I + LAM511水凝胶中显著提高了角质细胞分化的效率，并促进了皮肤发育中关键细胞类型（如真皮祖细胞、神经元、神经嵴来源的细胞和默克尔细胞）的分化。此外，在ECM中培养的纺锤形PSOs表现出毛囊形成效率的增强，在黑色素细胞和色素存在的条件下，效率高达80%。这种方法不仅促进了毛囊形成，还增加了毛囊标记物的表达，表明纺锤形PSOs在皮肤分化和附属器形成方面达到了更高级的阶段。研究结果表明，与传统培养方法相比，在ECM环境中使用纺锤形培养PSOs更有效地促进皮肤分化和毛囊形成，强调了微环境和培养几何形状在指导皮肤类器官发育和功能方面的重要性。

微流体纺锤形设备产生双向化学梯度

研究中的微流体纺锤形设备能够生成双向化学梯度，用以调控多功能干细胞衍生的皮肤类器官（PSOs）的空间分化。通过将微流体通道融入纺锤形培养系统，研究人员能够创建不对称的分化因子梯度，从而实现对类器官内形态发生因子分布的精确空间控制。该设备还能控制不同大小分子的扩散，有助于建立形态发生梯度，影响PSOs内真皮和表皮细胞的分化和组织。总体而言，微流体与纺锤形培养系统的整合为在嵌入细胞外基质的PSOs内创建精确化学梯度提供了新方法，为研究和操控皮肤类器官的空间组织和分化提供了可控且动态的平台。

形态发生梯度在空间上调控皮肤类器官（PSOs）的分化

研究表明，在微流体纺锤形设备中产生的形态发生梯度对多功能干细胞衍生的皮肤类器官（PSOs）的分化具有关键的空间调控作用。通过在一个通道中灌注表皮分化因子（BMP4/SB），在另一个通道中灌注真皮分化因子（FGF-2/LDN），研究人员能够创建不同的化学梯度，从而影响PSOs的发育和组织。微流体设备中特定分化因子的空间控制暴露导致PSOs的伸长和纺锤状生长，这与无微流体的纺锤形设备中观察到的形态相似。此外，与传统凝胶球状体培养条件相比，在微流体设备中培养的PSOs的细胞死亡水平较低，这表明控制形态发生梯度对于促进类器官的存活和功能至关重要。总体而言，通过微流体纺锤形设备中的形态发生梯度进行空间分化调控为研究皮肤类器官在受控微环境中的发育和组织提供了有价值的工具。这种方法允许对分化过程进行精确操控，从而增强对皮肤组织形态发生的理解，并在再生医学和疾病建模中具有潜在应用。

图1 纺锤形装置和微流控装置的设计。A）用PEGDA生物打印的纺锤形装置的3D设计；B）微流控装置3D设计的侧视图（左面板），用PEG/GelMA生物打印（中间面板），以及将微流控装置与3D打印的无泵摇动室组装在一起。

图2 在第14天，使用不同ECM水凝胶的PSOs生长和GFP模式的比较。A）PSO生成方法的示意图；B）不同水凝胶中EBs的明场和GFP图像；C）用于表示PSOs上GFP分布的实验方法示例（峰的数量；Np）；黄色虚线框表示在强度分布图中分析和表示的兴趣区域（ROI）。D）测量Np以显示不同水凝胶中PSOs的GFP分布：红色和蓝色虚线框分别显示不规则和规则的GFP表达的示例；E）在不同水凝胶中生长的PSOs的GFP阳性区域。统计显著性：（#p > 0.05，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，和****p < 0.0001）。比例尺：250 μm。

图3 在不同水凝胶中生长的PSOs的特性表征。A）第14天的PSOs横截面积；B）不同培养条件下PSOs的生长曲线；C）通过免疫荧光（IF）在第32天对不同培养条件下的PSOs中Krt14、PDGFα、TUJ1和Krt8（红色）的蛋白质表达进行表征；D）红色表示通过油红染色在第32天对不同培养条件下的PSOs中脂肪细胞进行表征。蓝色表示细胞核。比例尺：250 μm。统计显著性：（#p > 0.05，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，和****p < 0.0001）。

图4 纺锤形设备中几何形状对PSOs增殖和凋亡的影响。A）数值模拟比较了在3D ECM中生长的球形PSOs与纺锤形设备中纺锤形PSOs内的O2浓度分布（热图上的虚线表示PSO边界；右图中的O2张力显示为的PSOs中心）；B）在纺锤形设备中培养7天、14天和28天后PSOs的生长情况；C）不同时间点的PSO表面积；D）在第32天通过Caspase3（红色）进行免疫定位来表征PSOs的坏死部分；E）第32天对Cas3+阳性表达的细胞死亡进行量化；F）第32天通过TUNEL测定法（红色）对细胞死亡进行量化；G）第32天不同培养条件下EBs中死细胞与活细胞的比率。图中蓝色为细胞核。比例尺：250 μm。统计显著性：（#p > 0.05，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，和****p < 0.0001）。

图5 几何结构对第32天在LAM511水凝胶中培养的皮肤PSOs的分化和发育的影响。IF图像用于表征A）真皮间充质-PDGFRα（红色）和B）表皮分化-Krt14（黄色）和毛囊形成（白色箭头）；C）第32天不同培养条件下Krt14表达在总PSOs区域的量化；D）不同培养条件下PSOs中毛囊形成的效率；E）毛囊和表皮中的E-钙粘蛋白表达（红色）；F）毛囊中存在黑色素（黄色箭头），且TA99抗体表达呈阳性；G）在不同培养条件下，两次独立实验中PSOs中毛囊形成效率的实验重复性；H）红色为油红染色，用于脂肪细胞表征；I）不同培养条件下油红染色在总PSOs区域的量化。图中蓝色为细胞核。比例尺：250 μm。统计显著性：（#p > 0.05，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，和****p < 0.0001）。

图6 微流体设备中化学梯度的表征。分析A)高分子量（40 kDa）和B)低分子量（519 Da）分子的化学梯度；C)将HUVEC-GFP球状体（每个球状体含3000个细胞）嵌入3.7 mg/mL I型胶原蛋白水凝胶中，并在右侧（黄色）通道中设置VEGF梯度（1 ng/mL）进行发芽试验的实验设置；D)在存在VEGF梯度的情况下，HUVEC球状体发芽数量和长度的随时间变化；在存在VEGF梯度的情况下，对HUVEC球状体E)总发芽数、F)总长度和G)累积长度的量化。黄色虚线表示球状体的中轴线。白色箭头表示测量的发芽长度。比例尺：100 μm。统计显著性：（#p > 0.05，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，和****p < 0.0001）。

图7 化学梯度对皮肤PSOs增殖、凋亡、分化和发育的影响。A）在微流体设备中培养PSO的示意图；B）在培养7天、14天和24天后，微流体设备内PSOs的生长情况；C）第14天对Cas3+阳性表达的细胞死亡进行量化；D）不同时间点化学梯度对PSOs分化的影响；E）第32天，在不同培养条件下，微流体设备中PSOs的Krt14表达（红色）免疫荧光表征；F）不同培养条件下K14表达沿类器官区域的频率分布；G）表皮位于上侧的类器官的相位对比图像。蓝色为细胞核。比例尺：250 μm。统计显著性：（#p > 0.05，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，和****p < 0.0001）。

总结

这篇文章研究了如何通过在定义的三维细胞外基质（ECM）微环境中培育皮肤器官样体来有效生成皮肤类器官（PSOs）。研究表明，在ECM中培育具有纺锤状形态的PSOs有助于减轻坏死现象，提高类器官样本的生存率和功能性。纺锤状形态的PSOs在皮肤分化和促进毛囊形成方面表现出优势，有助于促进角质细胞分化和毛囊形成效率。此外，微流控纺锤装置能够产生双向化学梯度，空间调控PSOs的分化，为研究和操纵皮肤类器官的空间组织和分化提供了新的平台。通过在微流控纺锤装置中生成形态因子梯度，可以空间调控PSOs的分化，促进类器官样本的生存和功能。整体而言，这项研究为理解皮肤组织形态发生提供了重要见解，并在再生医学和疾病建模方面具有潜在应用。

参考信息

Efficient Generation of Skin Organoids from Pluripotent Cells via Defined Extracellular Matrix Cues and Morphogen Gradients in a Spindle-Shaped Microfluidic Device.Adv Healthc Mater. 2024 Mar 7:e2400405. doi: 10.1002/adhm.202400405.PMID: 38452278.

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