Nature Commun | 华大生命科学研究院联合揭示广陈皮中活性成分多甲氧基黄酮生物合成的遗传调控机制

责编 | 王一

茶枝柑（Citrus reticulata cv. Chachiensis）属于芸香科柑橘属宽皮橘，是古老的柑橘栽培变种，距今已有700 多年的种植历史, 主要分布于广东新会，其果皮是中药“广陈皮”的原材料，含有多种生物活性成分，包括类黄酮、萜类、生物碱以及多糖。“广陈皮”以其独特的理气健脾、燥湿化痰功效，被列为广东省首批立法保护的八大岭南中药之一。多甲氧基黄酮是广陈皮中关键的药用成分，具有消炎、抗病毒、抗氧化、清除自由基等生理活性，但目前对其生物合成的遗传基础以及调控机制的了解十分有限。

近日，华大生命科学研究院联合华南农业大学、中国药科大学和南京中医药大学在Nature Communications发表了题为An integrated multi-omics approach reveals polymethoxylated flavonoid biosynthesis in Citrus reticulata cv. Chachiensis的研究论文。该研究通过多组学技术破译了茶枝柑基因组的遗传图谱，揭示了多甲氧黄酮合成的潜在通路以及基因调控网络。该研究首次报道了一种新的甲氧基转移酶基因CcOMT1，该基因被证实能够直接合成氧化程度最高、活性成分显著的3,5,6,7,8,3’,4’-七甲氧基黄酮（HPMF）, 该化合物具有抗肿瘤起始的作用和抗神经炎症活性。这项研究从基因挖掘-代谢物合成-转录调控三个层次详细阐述了广成皮活性成分多甲氧基黄酮的合成调控机制，为“广陈皮”独特的药用价值提供科学支撑。

1.构建染色体级别高质量基因组图谱，为茶枝柑遗传育种和性状改良提供数据支撑

研究人员通过短读长测序数据与长读长测序数据相结合的策略，以及Hi-C 辅助组装技术，成功构建了茶枝柑染色体级别的高质量基因组，基因组大小为314.96Mb。茶枝柑基因组共含有蛋白质编码基因29,722 个，基因组进化分析表明，相比于莽山野橘，茶枝柑与克莱门氏柑橘的亲缘关系更相近。多甲氧基黄酮一般指含有3个及以上甲氧基基团的黄酮化合物，在植物当中，多甲氧基黄酮在柑橘属当中尤其丰富，而在柑橘属的物种当中，又以甜橙和茶枝柑所在的宽皮橘类为最。植物甲氧基转移酶，具有在底物上催化羟基形成甲氧基基团的活性，因此这一类酶成为多甲氧基黄酮合成的关键酶。茶枝柑果皮中含有种类丰富的多甲氧基黄酮，那么基因组中是否存在种类繁多的甲氧基转移酶基因呢？ 研究人员通过同源序列比对以及从头搜索的方式从茶枝柑基因中鉴定出了47个高可信度，且与多甲氧基黄酮合成直接相关的甲氧基转移酶基因，包括39 个咖啡酸 O-甲基转移酶（COMT）基因和8 个咖啡酰辅酶A O-甲基转移酶（CCoAOMT） 基因，主要分布在3号染色体和9号染色体上。

图1. 茶枝柑基因组图谱

2.不同发育阶段多甲氧基黄酮合成和积累的变化规律

每年的9月~12月是茶枝柑果皮采收的季节，不同时间段采收的果皮制作出来的陈皮也有不同的功效。为了解析不同发育阶段多甲氧基黄酮合成和积累的变化规律，研究人员在广陈皮的道地产区新会采集了茶枝柑不同发育时期的花、叶以及果实等组织进行转录组测序研究，发现多甲氧基黄酮合成的关键酶--甲氧基转移酶在不同发育阶段、不同组织中的表达模式存在差异，也暗示不同组织不同发育阶段多甲氧基黄酮的含量存在差异。通过代谢组检测，研究人员在茶枝柑的不同组织中共发现29种多甲氧基黄酮化合物，并且不同发育阶段多甲氧基黄酮的相对含量确实存在着差异，但是大多数的化合物相对含量在花后200天（9月）的果皮中达到最高，也说明该时间段是茶枝柑果实采摘的适宜期。

图2. 茶枝柑的甲氧基转移酶基因以及不同发育时期的茶枝柑组织样本

3.首次发现一种新的甲氧基转移酶基因CcOMT1，可以合成具有抗肿瘤活性的化合物

3,5,6,7,8,3’,4’-七甲氧基黄酮（HPMF）具有抗肿瘤起始的作用，可能成为治疗癌症的潜在候选药物，但是其生物合成的途径未知。从代谢组数据中，研究人员发现柚皮黄素（3-羟基-5,6,7,8,3',4'-六甲氧基黄酮）的相对含量与七甲氧基黄酮（3,5,6,7,8,3’,4’-七甲氧基黄酮）的相对含量显著相关，并且从化合物结构上推断，柚皮黄素的3-羟基经过甲基化后可以生成3,5,6,7,8,3’,4’-七甲氧基黄酮（HPMF）。基于上述推断，研究人员进行相关酶的筛选与鉴定，成功表征出甲基转移酶CcOMT1的活性，实验证实该酶确实能够催化柚皮黄素合成3,5,6,7,8,3’,4’-七甲氧基黄酮。同时，体内瞬时过表达和基因沉默实验同时均证明CcOMT1能够显著改变茶枝柑果皮中的3,5,6,7,8,3’,4’-七甲氧基黄酮的含量。因此，CcOMT1被认为是茶枝柑中3,5,6,7,8,3’,4’-七甲氧基黄酮合成的候选酶，这也是首次报道的可直接合成3,5,6,7,8,3’,4’-七甲氧基黄酮的甲氧基转移酶。

图3. 3,5,6,7,8,3’,4’-七甲氧基黄酮（HPMF）合成途径

4.环境胁迫造就特殊的茶枝柑类黄酮基因表达调控网络，进而形成特殊的黄酮组分

通过关联分析研究人员还发现了以转录因子AP2/ERF、bZIP、WRKY等为核心的多甲氧基黄酮合成基因调控网络。AP2/ERF-ERF这些转录因子，能够响应干旱、盐害等非生物胁迫，而这些环境压力与茶枝柑的自然生长条件高度吻合。 新会地区，作为茶枝柑的道地产区，其独特的地理位置——西江支流、潭江以及银洲湖出海口的交汇处，为茶枝柑的生长提供了特有的盐胁迫环境。这种环境条件对茶枝柑的生长发育和次生代谢产物的合成具有重要影响。研究进一步发现，与广东惠州、台山和广西玉林等非道地产区相比，新会地区的茶枝柑中，转录因子AP2/ERF-ERF、HB-HD-ZIP和LIM的表达量显著更高。这种表达模式的差异，促进了多甲氧基黄酮合成相关基因的活性，从而增强了新会茶枝柑果实中多甲氧基黄酮的生物合成，为新会陈皮的高品质形成提供了分子层面的解释。

通过多组学数据相结合的方法可以加速药用植物基因资源的挖掘，该研究为茶枝柑基因组辅助育种、品种鉴定、活性成分合成、广陈皮药用质量保障以及品质提升奠定了坚实的基础。这也是该课题组在2023年3月在国际期刊《微生物组》上发表“微生物和土壤养分影响茶枝柑活性成分单萜积累”的系列文章后，再次通过基因组解析了茶枝柑活性成分多甲氧基黄酮合成的遗传调控机制。

深圳华大生命科学研究院，中国科学院大学华大教育中心硕士生温嘉雯、深圳华大生命科学研究院王亚玉副研究员、中国药科大学陆续副教授、华南农业大学博士生潘慧敏为该论文共同第一作，深圳华大生命科学研究院刘欢研究员、南京中医药大学刘鄂湖教授、华南农业大学吴鸿教授为论文共同通讯作者。

论文链接：

https://www.nature.com/articles/s41467-024-48235-y