再生医学之光：肝胆类器官移植猴模型，肝功能显著改善！

文章介绍

2024年1月21日，中国科研工作者在期刊International Journal of Biological Sciences（IF:9.2003）发表了一篇题为“Hepatobiliary organoids differentiated from hiPSCs relieve cholestasis-induced liver fibrosis in nonhuman primates”文章。

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摘要

Abstract

研究发现，人诱导多能干细胞来源的肝胆类器官（HBOs）在猴子模型中移植后，能有效改善肝脏保护功能，通过抗凋亡和抗纤维化药物发挥作用。HBOs移植可促进肝脏窦状内皮细胞中CTSV的表达，有助于阻止肝纤维化的进展。肝脏原位和肠系膜下移植途径各有优势，肠系膜下移植抗纤维化效果更显著。总之，HBOs移植可能是治疗严重肝病的有效安全方法。

#2

研究方法

Methods

本研究采用多种方法，包括诱导hiPSCs分化为HBOs、在非人灵长类动物模型中进行肝脏原位和肠系膜下移植、免疫荧光染色、RNA提取和测序分析、数字病理扫描和激光共聚焦显微镜观察等，全面评估HBOs在缓解胆汁淤积引起的肝纤维化中的潜力。这些综合方法有助于深入探索HBOs移植对肝脏损伤愈合的机制，为肝病治疗提供重要启示。

主要解析一下诱导hiPSCs分化为功能性肝胆类器官（HBOs）的具体步骤:

1. 细胞系和培养条件：

- 使用hiPSC系列UC（第30至第37代）进行细胞培养。

- 将未分化的hiPSCs培养在Matrigel基底膜基质生长因子减少型（Corning, NY, USA）涂覆的6孔板上，并在37℃、5% CO2和95%空气条件下用mTeSR培养基维持。每24小时更换培养基。

2. HBOs分化：

- HBOs的分化始于hiPSCs至少在体外培养5代后。采用先前描述的特定分化方案，根据需要进行适当的修改。

- hiPSCs使用Accutase分散成团，并均匀传代在预先涂覆Matrigel的新6孔板上。当细胞达到约90%的密度时，用含有2% B27补充物去除胰岛素（B27-）、1% 青霉素/链霉素、100 ng/mL 活化素A和10 ng/mL BMP4（PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA）的RPMI 1640培养基培养5小时。

- 然后，在上述RPMI 1640/(B27-)培养系统中加入5% mTeSR，并持续培养2天。

- 为了诱导细胞进入定向的内胚层阶段，将培养基更换为含有2% B27-、1% 青霉素/链霉素、5% mTeSR和100 ng/mL 活化素A的RPMI 1640，继续培养2天。

通过这些分化步骤，研究团队成功地将hiPSCs分化为具有肝胆特异性标记物和排泄功能的HBOs，为后续的移植实验奠定了基础。

#3

主要结果

Results

用于移植的最佳诱导HBOs的特征

在这项研究中，对诱导形成的肝胆类器官（HBOs）进行优化表征，对于评估其移植潜力至关重要。随着时间的推移，观察到HBOs的形态变化，它们从肝脏祖细胞阶段过渡到成熟的肝细胞，并具有囊泡状胆管细胞系。通过免疫组织化学和免疫荧光染色，证实了特定标记物的表达，包括CK19（用于胆管细胞）、ALB和CYP3A4（用于肝细胞）以及CD31（用于血管内皮结构）。功能分析表明，HBOs具有与人类肝细胞相似的脂质储存和分泌功能。此外，HBOs不表达多能性标记物，表明其形成畸胎瘤的风险较低。这些全面的表征使得能够选择适合移植实验的HBOs，从而确保其潜在的治疗应用。

HBO移植对胆汁淤积所致肝纤维化猴肝酶的保护作用

本研究评估了肝胆类器官（HBO）移植在胆汁淤积诱导的肝纤维化猴子模型中对肝脏酶的保护作用。通过胆汁管结扎（BDL）建模诱导猴子肝纤维化，并在移植前五天开始免疫抑制治疗。实验结果显示，在BDL纤维化模型组中，建模后血清中的天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平逐渐升高，第二周达到峰值，约为建模前的10倍。然而，HBO移植对胆汁淤积诱导的肝纤维化猴子模型中的肝脏酶具有保护作用，有助于降低升高的AST水平，从而可能减轻与胆汁淤积诱导的纤维化相关的肝损伤。这些发现表明，HBO移植有可能减轻肝损伤并改善胆汁淤积诱导的肝纤维化中的肝功能。因此，HBO移植作为治疗胆汁淤积诱导的纤维化特征性肝病的治疗策略具有潜在的治疗价值。

图1 HBO移植治疗的放射学和生化评估。（A）非人类灵长类动物肝纤维化模型的移植和实验阶段的时间表。时间表包括动物训练、实验治疗阶段和牺牲点。（B）肝脏原位和肠系膜下移植程序的示意图。（C）HBO移植后不同时间点非人类灵长类动物的生化参数变化。AST，天冬氨酸氨基转移酶；ALT，丙氨酸氨基转移酶；ALP，碱性磷酸酶；GGT，γ-谷氨酰转移酶。每组3只恒河猴。A表示BDL模型组中post-Tx与pre-Tx的P<0.05。B表示肝脏原位移植组中post-Tx与pre-Tx的P<0.05。C表示肠系膜下移植组中post-Tx与pre-Tx的P<0.05。（D）肝脏横截面的超声图像表示。每组3只恒河猴。（E）肝脏病变的轴向计算机断层扫描（CT）图像。(F) HBO移植后肝血管直径变化的定量分析。每组3只恒河猴。平均值±标准差。A表示BDL模型组中post-Tx与pre-Tx的P<0.05。B表示肝脏原位移植组中post-Tx与pre-Tx的P<0.05。C表示肠系膜下移植组中post-Tx与pre-Tx的P<0.05。BDL model，未进行HBO移植的胆管结扎纤维化模型组；Liver subcapsular Tx，肝脏原位移植组；Submesenteric Tx，异位肠系膜下移植组；Pre-Tx，建模和移植前；1 w post-Tx，建模和移植后1周；2 w post-Tx，建模和移植后2周；3 w post-Tx，建模和移植后3周；4 w post-Tx，建模和移植后4周；5 w post-Tx，建模和移植后5周；6 w post-Tx，建模和移植后6周；7 w post-Tx，建模和移植后7周；8 w post-Tx，建模和移植后8周。

腹部超声波和 CT 扫描显示，HBO移植具有缓解肝胆汁淤积症的潜力

该研究利用腹部超声和CT扫描评估了肝胆类器官（HBO）移植对肝胆汁淤积的影响。研究发现，与BDL模型组相比，接受肝脏原位和肠系膜下HBO移植的组在移植后8周时，共同胆管和左肝管扩张的程度较低，暗示胆汁淤积可能得到缓解。此外，CT扫描显示，与BDL模型组相比，HBO移植组的肝脏低密度阴影区域比例减少，表明胆汁淤积可能有所改善。

HBO移植可有效、安全地预防胆汁淤积性肝损伤引起的脾肿大

该研究采用胆汁管结扎（BDL）诱导的胆汁淤积性肝损伤猴子模型，以评估HBO移植对肝脏和脾脏形态的影响。通过肝脏原位和肠系膜下途径进行HBO移植，并定量比较了不同实验组之间肝脏和脾脏的大小。结果显示，BDL模型组与HBO移植组之间肝脏和脾脏形态存在显著差异，HBO移植组的肝脏包膜光滑完整，脾脏体积显著小于模型组，暗示HBO移植可能有效缓解胆汁淤积性肝损伤引起的脾肿大。同时，对关键器官的组织学检查及肾功能、心脏标志物、常规血液指标和凝血功能指标的评估显示，HBO移植未引起畸胎瘤形成，且全身安全性良好。

图2 HBO移植减轻了肝纤维化和凋亡。(A-B) BDL模型猴子以及接受HBO移植的猴子的肝脏和脾脏的代表图(A)，器官大小的定量分析(B)。比较结果已显示。*表示P<0.05。模型组、肝脏原位组和肠系膜组各有3只猴子。(C) HE染色石蜡包埋组织切片的组织学评估。HE染色显示HBO移植后无肿瘤形成的证据。比例尺=400μm。(D) 通过TUNEL试验评估肝脏切片中的凋亡，该试验显示纤维化肝脏中的DNA链断裂。比例尺=100μm。(E) 通过使用马松三色和Sirius Red染色对石蜡包埋的肝切片进行染色，检查纤维化的程度。HE、马松（蓝色染色区域）和Sirius Red（红色染色区域）染色的代表性显微照片显示载玻片中存在胶原纤维。比例尺=100μm。(F) 每视野TUNEL阳性细胞数的统计结果（n=5）。平均值±标准差。*P < 0.05。(G) 通过使用Image-Pro plus分析系统对马松三色阳性组织进行半定量分析，评估纤维化。*表示P<0.05。(H) 通过计算Sirius Red相对于每个视野中背景量的密集强度，对肝脏切片中的Sirius Red区域进行定量分析。平均值±标准差。*P < 0.05。Control，未接受治疗的健康猴子；BDL model，未接受HBO移植的胆汁管结扎纤维化模型组；Liver subcapsular Tx，肝脏原位移植组；Submesenteric Tx，异位肠系膜下移植组。(I) 基于BDL模型1组与肝脏原位移植组、BDL模型2组与肠系膜移植组之间肝脏纤维化病理区域的RNA测序研究，展示了六个与肝纤维化相关基因（FN1、VTN、LECT2、PPARGC1B、NR4A1和ARRB1）的表达值，以log10 1+TPM表示。FN1，纤连蛋白1；VTN，玻连蛋白；LECT2，白细胞衍生趋化因子2；PPARGC1B，过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1β；NR4A1，核受体亚家族4组A成员1；ARRB1，阻遏蛋白β1；BDL model-1，用于与肝脏原位移植组比较的未接受HBO移植的胆汁管结扎纤维化模型组；Liver subcapsular Tx，肝脏原位移植组；BDL model-2，用于与肠系膜下移植组比较的未接受HBO移植的胆汁管结扎纤维化模型组； Submesenteric Tx，异位肠系膜下移植组。

胆汁淤积相关的细胞凋亡和纤维化可通过 HBO 移植得到缓解

本研究评估了HBO移植在胆汁淤积性肝损伤中的作用。结果显示，HBO移植显著减少了BDL模型组中的肝细胞凋亡和纤维化。HBO移植的抗纤维化机制可能涉及多种因素，如LSECs中CTSV的高表达。综上，HBO移植在胆汁淤积性肝病中有治疗潜力，通过减轻凋亡和纤维化，促进肝脏再生。

移植HBO可抑制肝窦毛细血管化并上调 CTSV 基因表达

研究发现，肝胆类器官（HBOs）移植在肝脏疾病治疗中显示出显著效果。通过移植HBOs，研究观察到肝脏窦状毛细血管化的抑制以及CTSV基因表达的上调。这种抑制毛细血管化的作用通过减少CD31阳性染色区域得到体现，暗示了HBO移植在维护肝脏窦状正常结构和功能方面的重要作用。同时，HBO移植导致的CTSV基因表达增加可能有助于减缓肝脏窦状毛细血管化和肝纤维化的进程，揭示了一种潜在的抗纤维化机制。

图3 HBO移植减少了窦状毛细血管化并影响了肝脏中的基因表达。（A）使用Lyve1和CD31免疫染色定位和评估肝脏窦状毛细血管化的程度。Lyve1：绿色，CD31：红色。比例尺=75μm。（B）每个视野中CD31阳性区域的定量分析（n=6）。平均值±标准差。*P<0.05。（C）使用火山图筛选BDL模型与肝脏原位移植组之间mRNA的基因组规模差异表达水平。（D）基于RNA测序（RNA-seq）分析，肝包膜下移植HBO后肝脏中上调基因的前10名排名。在上调基因中，我们注意到CTSV基因，它可以参与基质降解和细胞侵袭。（E）BDL模型和肠系膜下移植猴肝脏样本的RNA-seq分析的火山图。（F）基于RNA-seq分析，肠系膜下移植HBO后肝脏中上调基因的前10名排名。在10个上调基因中，我们注意到一组与细胞归巢相关的MMPs基因（MMP10、MMP1和MMP27）。Log2FC，Log 2倍变化。-log10P，P值的负对数。对照组，未接受治疗的健康猴；BDL模型组，未进行HBO移植的胆管结扎纤维化模型组；Liver subcapsular Tx，肝脏原位移植组；Submesenteric Tx，异位肠系膜下移植组。

在窦周纤维化程度极低的情况下，LSECs在移植HBOs的诱导下表现出高水平的CTSV表达

研究发现，肝胆类器官（HBO）移植后，肝脏窦状内皮细胞（LSECs）中CTSV基因表达上调，与窦周纤维化最小化相关。CTSV能降解主要沉积于肝脏窦状中的胶原 XVIII，对纤维化过程有调节作用。HBO移植可能通过诱导LSECs中CTSV的高表达，预防或逆转肝脏窦状毛细血管化和纤维化。这一发现表明，HBO移植通过调节CTSV表达和潜在影响胶原降解，可能在预防或逆转与胆汁淤积性肝损伤相关的肝纤维化中发挥治疗作用，保护肝脏窦状正常结构和功能。

图4 HBO移植诱导的CTSV高表达存在于LSECs中，有助于改善窦周纤维化。（A-C）通过HPA数据库的单细胞类型和组织细胞类型切片分析CTSV基因表达。结果表明，CTSV与肝脏窦状内皮细胞高度相关，并可在这些细胞中表达。（D）对HBO移植治疗8周后的肝脏组织切片进行CTSV、Lyve1和α-SMA的免疫荧光染色。代表性显微图像显示，与BDL模型组相比，HBOs Tx组中CTSV的存在增加，而α-SMA的表达减少。比例尺=50μm。（E）使用IPP软件对CTSV和α-SMA免疫荧光强度进行定量分析。随机选择六个视野。所有数据均以平均值±标准差表示。*P<0.05被认为具有显著性。（F）HBOs中CTSV阳性细胞的代表性免疫组织化学图像。用红色箭头指示的棕色区域中染色阳性的细胞为CTSV阳性细胞。结果表明，用于移植的HBOs中CTSV表达量高。比例尺=100μm。Control，未接受治疗的健康猴；BDL model，未进行HBO移植的胆管结扎纤维化模型组；Liver subcapsular Tx，肝脏原位移植组； Submesenteric Tx，异位肠系膜下移植组。

移植HBO诱导形成新的DR模式，并减缓肝纤维化的进程

免疫组化分析显示，HBO移植后，肝脏组织中的α-SMA和CK19表达模式变化。BDL模型组出现活跃的导管反应，而HBO移植形成新的导管反应模式。同时，HBO移植调节纤维化过程，减缓肝纤维化进展。

图5 HBO移植刺激了新型导管反应模式的形成并抑制了肝纤维化的进展。（A）肝脏组织中CK19和α-SMA的免疫组织化学染色。比例尺=300μm。（B）CK19和α-SMA的免疫荧光双染。蓝色为细胞核DAPI染色。红色为α-SMA染色，绿色为CK19染色。在HBO Tx组中，CK19位于α-SMA阳性纤维化区域的周围，而BDL模型组则呈现相反的模式。比例尺=100μm。（C-D）HBO移植后肝脏不同区域SC121阳性细胞的代表性免疫组织化学图像。结果表明，SC121标记的人细胞归巢至肝脏。比例尺=100μm。（E）SC121阳性区域与整个肝组织区域的比例。所有数据均以平均值±标准差表示。P<0.05被认为有统计学意义。（F-G）HBO移植后，主要器官中SC121阳性细胞的代表性免疫组织化学成像。比例尺=100μm。（H-I）猴肝组织用hALB抗体进行免疫荧光染色，并确定含有肝细胞的人细胞在肝脏中保留或归巢。比例尺=100μm。（J）使用IPP软件对hALB免疫荧光强度进行定量分析。随机选择六个视野。所有数据均以平均值±标准差表示。P<0.05被认为有统计学意义。Control，未治疗的健康猴子；BDL model，无HBO移植的胆管结扎纤维化模型组；Liver subcapsular Tx，肝脏原位移植组；Submesenteric Tx，肠系膜下异位移植组。

HBO可在HBO移植后安全有效地保留或归位到受伤的肝脏中

HBO（人类胆管祖细胞）移植后在肝脏中留存、归巢、安全性和功效。HBOs成功地在受损肝脏中留存，并在肝脏微环境中稳定植入。它们在肝脏组织中的留存对于其功能整合和潜在的治疗效果至关重要。HBOs显示出向受损肝脏组织的高效归巢能力，这涉及到它们迁移到肝脏损伤部位，发挥再生和保护功能。HBOs在受损肝脏中的留存和归巢证实了其作为治疗策略的可行性和有效性，为长期维持和功能活动提供了潜力。此外，这些发现强调了HBO移植在肝脏再生和纤维化治疗中的安全性、效率和治疗潜力，为肝病管理中基于细胞的靶向治疗提供了可能性。

MMP家族基因可能是促进HBO有效滞留或归巢的效应因子

HBO移植后，MMP家族基因在移植肝脏中上调，促进HBOs在受损肝脏的留存和归巢。与BDL模型相比，多种MMP成员表达增加。不同移植途径下，MMP表达有差异。了解MMP在HBO留存和归巢中的作用，有助于优化移植策略，提高HBO治疗肝脏疾病的效果。

图6 在HBOs移植后，MMP家族基因显著上调，可能是介导HBOs有效留存或归巢的潜在效应器。(A) 在肠系膜下移植HBOs后，肝脏中差异表达基因中的MMPs相关基因的热图。BDL model-1、BDL model-2、BDL model-3分别代表胆管结扎纤维化模型猴1、2、3；Submesen-1、Submesen-2、Submesen-3分别代表异位肠系膜下移植猴1、2、3。(B) 在肠系膜下移植组中，上调最显著的四种MMPs基因的表达值已用log10 1+TPM表示。BDL model，未进行HBO移植的胆管结扎纤维化模型组；Submesenteric Tx，异位肠系膜下移植组。(C) 在肝脏原位移植HBOs后，肝脏中差异表达基因中的MMPs相关基因的热图。BDL model-1、BDL model-2、BDL model-3分别代表胆管结扎纤维化模型猴1、2、3；Liver Tx-1、Liver Tx-2、Liver Tx-3分别代表肝脏原位移植猴1、2、3。(D) 在肝脏原位移植组中，上调最显著的四种MMPs基因的表达值已用log10 1+TPM表示。BDL model，未进行HBO移植的胆管结扎纤维化模型组； Liver subcapsular Tx，肝脏原位移植组。

总结

这项研究评估了人类诱导多能干细胞（hiPSCs）分化形成的肝胆类器官（HBOs）在治疗胆汁淤积引起的肝纤维化中的潜力。研究发现，HBOs在移植后能安全有效地在受损肝脏中留存和归巢，显示出对肝纤维化的治疗潜力。此外，MMP家族基因的上调可能促进了HBOs的留存和归巢。CTSV基因在移植后的肝内表达增加，可能有助于逆转病理性肝内内皮细胞的毛细血管化和保护肝脏。这些发现表明，HBOs作为一种潜在的细胞治疗策略，为肝脏疾病的再生和纤维化治疗提供了新的可能性。未来的研究将聚焦于进一步理解MMP家族基因和CTSV基因在HBOs治疗中的作用机制，以优化治疗效果。

参考信息

Hepatobiliary organoids differentiated from hiPSCs relieve cholestasis-induced liver fibrosis in nonhuman primates.Int J Biol Sci. 2024 Jan 21;20(4):1160-1179. doi: 10.7150/ijbs.90441.PMID: 38385067 PMCID: PMC10878143.

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