对虾养殖，解决EHP的一条新方法！或将解决养虾大难题！

研究结果表明，EhPTP2蛋白在EHP的生命周期中至关重要，尤其是，靶向宿主细胞中的EHP mRNA可以有效的。

一、预防和治疗EHP的新途径

虾微孢子虫 ( EHP) 感染对虾的肝胰腺 (HP) 和肠道，包括：养殖的南美白对虾 ( Penaeus vannamei ) 和斑节对虾 ( P. monodon )。虾的严重感染会导致生长迟缓，并随后导致产量下降。

微孢子虫是专性细胞内寄生虫，具有特征性感染性孢子，其中含有称为极性管的入侵细胞器。双层孢子壁，由外层（外孢子）和富含几丁质的内层（内生孢子）组成，使孢子能够承受恶劣的外部环境。

在诱导后或在适当的条件下，孢子伸出其极管刺穿宿主细胞，以便在称为萌发的过程中启动细胞内生命周期。极管用作孢子质（某些寄生微生物的孢子的内容物，被注射到并感染宿主细胞中）转移到宿主细胞中的导管。据Weiss及其同事的研究，许多刺激都会引发孢子萌发。极管由不同的极管蛋白组成，目前已鉴定出7种极管蛋白，分别命名为PTP1至PTP7。

EHP孢子的热灭活已被证明可以防止孢子挤出，从而抑制孢子的感染性，这表明孢子挤出过程是虾中EHP感染的先决条件。RNA干扰 (RNAi) 是一种已应用于虾病毒预防和治疗方面的各种研究的技术。先前的研究支持这样的假设：RNAi沉默PTP会减少微孢子虫感染。

在这项研究中，我们假设极管蛋白EhPTP2与孢子萌发有关。因此，我们预测EhPTP2的沉默会抑制EHP复制，减少EHP拷贝数，并减少EHP传播。这项研究为进一步开发基于抑制EhPTP2的EHP感染可能的治疗或预防疗法提供了平台。

二、研究设置

为了鉴定参与孢子萌发过程的蛋白质，从EHP感染的南美白对虾的肝胰腺 (HP) 中分离出EHP孢子。孢子被孵化和萌发，并选择最丰富的EHP孢子蛋白进行分析。

我们假设这些极管蛋白之一EhPTP的存在，可能是EHP孢子成功挤出所必需的。为了验证这一假设，我们将EhPTP2特异性双链RNA (dsRNA) 注射到健康虾中，发现它明显减少了受感染虾中的EHP拷贝数。

三、结果与讨论

1、我们的结果表明，有两种方法：免疫荧光测定（IFA；免疫学或分子生物学中常用的一种重要技术，用于检测特定蛋白质的存在和分布）和免疫组织化学（IHC；一种免疫染色形式，用于选择性识别细胞和组织中的蛋白质） – 检测EhPTP2蛋白表达可用于监测受感染虾中EHP孢子的萌发和定位。

2、由于需要高放大倍率镜头 (100x)，通过光学显微镜进行EHP孢子检测具有挑战性。针对与EHP相关的特定基因或蛋白质可以提供更灵敏和特异的检测。EHP的极管蛋白2(EhPTP2) 由于参与极管挤出过程而成为有价值的检测靶标，而极管挤出过程构成了寄生虫生命周期的关键步骤。

我们的研究表明，针对EhPTP2蛋白可用于检测分离孢子样品中挤出的EHP孢子。这一发现表明IFA可能有利于监测EHP孢子萌发。

此外，除了检测活孢子外，EhPTP2还可以用作使用IHC检测虾组织切片中EHP感染的靶点（图1）。我们的发现支持使用EhPTP2检测作为EHP感染的诊断方法，这与之前使用其他技术检测EhPTP2的报道一致。

图1：使用免疫组织化学在肝胰腺和肠道中检测到的EHP极管蛋白EhPTP2。

3、结果还表明，肠道内的发芽可能不会导致成功的感染。除了之前报道的在肝胰腺（HP）中萌发外，还从肠道中分离出少量萌发的孢子，并通过EhPTP2的免疫组织化学检测到。沿着虾的消化道，有一个胃筛 (GS)，用作直径约0.2-0.7微米颗粒的尺寸排除过滤器。

较大的颗粒被转移到肠道而不是HP。由于EHP椭圆形孢子的平均尺寸约为1微米长，因此在肠道中检测到的萌发孢子可能来自于GS从HP中排除尺寸的孢子。虽然在肠道中检测到萌发的孢子和免疫组织化学的EhPTP2阳性信号，但证据仍不足以得出肠道是EHP的另一个增殖位点的结论。相反，我们推测组织学结果中存在的萌发孢子是粪便污染的残余物，而不是活动性感染。

4、关于EhPTP2抑制的治疗和预防应用，由于EhPTP2与极管挤压有关，这表明抑制EhPTP2信使核糖核酸（mRNA；参与细胞中的蛋白质合成）将抑制挤压过程，并导致EHP感染减少。当EhPTP2特异性双链核糖核酸（dsRNA；与大多数病毒感染相关，它要么构成 dsRNA 病毒的病毒基因组，要么在病毒复制过程中在宿主细胞中产生）被肌内注射到之前的体内时EHP感染虾，情况确实如此（图2）。

图2：EHP感染虾中EhPTP2 mRNA表达的抑制会对水平传播率产生负面影响。

5、当预防性应用RNAi技术时，在接触病原体之前，虾体内的关键毒力基因被敲低，从而抑制感染的情况并不少见。例如，在一个养殖池塘中，观察到群体中EHP感染水平存在很大差异。注射dsRNA并表现出EHP感染的虾中，有可能是感染了高水平EHP。如果可以应用第四剂dsRNA-EhPTP2，能够减少感染。在这项研究中，有希望的是，一旦感染已经在两个方面建立，施用EhPTP2特异性dsRNA就可以用于治疗：

(1)减少受感染虾中的EHP负荷；

(2) 减少受感染虾中EHP的进一步虾池的传播。

6、考虑到EHP感染是慢性的，并且在EHP拷贝数达到总肝胰腺DNA 10∧3个拷贝的临界阈值之前，对生长的负面影响并不明显，现有数据表明，常规监测和dsRNA治疗应用相结合对抗EHP极管蛋白EhPTP2可能具有控制EHP的潜力。

四、研究观点

这项研究的结果表明，EhPTP2在EHP的生命周期中起着至关重要的作用，并且靶向EHP mRNA的dsRNA可以有效地到达在宿主细胞中发育的寄生虫。这种方法是未来研究的模型，旨在确定EHP生存和传播的关键基因，作为对虾预防和治疗的措施。