《食品科学》：福建农林大学林河通教授等：基于Illumina MiSeq测序技术探究冷藏菊黄东方鲀菌群演替规律

菊黄东方鲀（Takifugu flavidus）属鲀形目、鲀科、东方鲀属。其肉质细嫩，味道鲜美，营养丰富，蛋白质含量高，同时富含多种必需氨基酸和钾、磷、钙等多种矿物质。由于菊黄东方鲀体内蛋白质和水分含量较高，容易受到外源微生物的侵染，少部分微生物在鱼体内不断繁殖 ，迅速生长成为鱼体的特定腐败菌，严重影响鱼肉的品质和贮藏期。 高通量测序技术作为一种免培养的分子生物学技术，通过提取样品中微生物的DNA或RNA进行生物信息学分析，从而得到具体的群落多样性信息。 高通量测序技术在河鲀中的应用主要在于探究河鲀肠道微生物的菌群结构分布。

福建农林大学食品科学学院的曾鹭、林河通*和福建水产研究所的刘智禹*等人 以菊黄东方鲀冷藏过程的菌落总数（TVC）和挥发性盐基氮（TVB-N）值测定结果为依据，确定贮藏终点，通过高通量测序技术分析养殖菊花东方鲀鱼肉在冷藏前期（0～3 d）、中期（3～6 d）、后期 （6～15 d）的菌相演替变化规律，最终确定菊黄东方鲀冷藏期间的优势腐败菌及其致腐能力，以期为后期靶向抑制及品质控制提供理论依据。

1 菊黄东方鲀冷藏期间TVC和TVB-N值变化情况

如图1所示，在贮藏过程中冷藏菊黄东方鲀的TVC逐渐增加，5 d达到了4.93（lg（CFU/g）），接近生鱼肉可食用上限值，而在11 d TVC升至7.32（lg（CFU/g）），超过食品中微生物的最高限值7.00（lg（CFU/g）），因此可以说明菊黄东方鲀在冷藏情况下能贮藏5 d，冷藏到11 d已经腐败。

如图2所示，随着冷藏时间的延长，微生物数量不断增加，促进了蛋白质降解，使得菊黄东方鲀的TVB-N值从7 d以后迅速增加，到9 d TVB-N值增加到12.16 mg/100 g，达到上限值；到11 d TVB-N值已超过可接受上限值。

2 16S rDNA高通量测序结果

2.1 有效序列长度

通过细菌V3～V4区的测序，对各样本数据进行质控过滤，得到有效数据。从河鲀鱼肉共检出70.80多万条有效序列，平均长度在380～398 碱基对，在相似度97%的水平上进行归类操作，发现样品在种属水平上分类，共聚成2 026 个可操作分类单元（OTU）。 如图3、4所示，当测序量低于10 000时，稀释曲线呈现显著上升趋势，当测序数量逐渐增加达 到40 000时，曲线已趋于平缓，且Shannon曲线已经完全达到饱和状态，说明细菌多样性已经得到充分展示，不会再发生变化，本研究测序量满足后续生物信息学分析要求。

2.2 多样性分析

如表1所示，河鲀鱼肉的Chao1指数在第3天达到最大值，随后逐渐减小，说明河鲀冷藏3 d细菌群落的OTU数目最多，菌群丰度最大；Simpson指数越小，菌群多样性越高，鱼肉在第3天的Simpson指数为0.20，此时菌群多样性最高，随后降低 ，说明随着冷藏时间的延长，环境中氧含量逐渐降低，蛋白质等大分子被分解，为优势物种的快速生长提供条件，同时抑制了部分微生物的生长，导致后期多样性和丰富度下降。

2.3 菌群结构分析

菌群变化柱状图可以直观展示样本随着冷藏时间的延长，微生物物种组成及比例的变化情况。通过对比数据库，对OTU进行物种分类，并分别在门、纲、目、科、属水平作优势物种相对丰度柱状图（丰度占比小于1%的物种归类为others）。

2.3.1 菌群门、纲水平分布

养殖菊黄东方鲀在0 ℃冷藏过程中鱼肉的菌群变化丰富，在门水平上检测到占比较大的菌门，分别有变形菌门（Proteobacteria）、蓝细菌门（Cyanobacteria_Chloroplast）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和放线菌门（Actinobacteria）等，在纲水平上检测到了变形菌纲（Gammaproteobacteria）、叶 绿 体 纲（ Chloroplast ） 、 α-变 形 杆 菌 纲（Alphaproteobacteria）和梭菌纲（Clostridia）等。从图5a可以看出，在冷藏前期，蓝细菌门在鱼肉微生物菌群中的占比最大，达到56.60%，其次为未分类的细菌，所占比例为9.31%。随着冷藏时间的延长，蓝细菌门比例显著降低，由46.51%减少至1.22%，而变形菌门的比例则显著增长，从15.90%增长至96.50%（15 d），冷藏期间最高占比为99.28%，成为菊黄东方鲀冷藏期间的优势菌门。

整个贮藏过程纲水平的相对丰度分布情况与门水平相似，但是在纲水平中出现了更多的细分，变形菌门主要分为α-变形菌纲、β-变形菌纲（Betaproteobacteria）和γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria），厚壁菌门主要细分为梭菌纲和芽孢杆菌纲（Bacilli），拟杆菌门包括黄杆菌纲（Flavobacteriia）和鞘脂杆菌纲（Sphingobacteriia）（图5b）。

2.3.2 菌群属水平分布

菊黄东方鲀冷藏过程中，在属水平上的微生物菌群变化共有10个主要的菌属，分别为假单胞菌属（Pseudomonas）、链霉菌属（Streptophyta）、希瓦氏菌属（Shewanella）、梭菌属（Clostridium_sensu_stricto）、鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas）、黄杆菌属 （Flavobacterium）、不动杆菌属（Acinetobacter）、苯基杆菌属（Phenylobacterium）、鞘氨醇菌属 （Chitinophaga）、食酸菌属（Acidovorax）（图6）。

随着冷藏时间的延长，鱼肉中主要菌属由9 种增加至12 种，随后逐渐递减为假单胞菌属、希瓦氏菌属，作为水产品中常见的优势腐败菌，经常在腐败过程中发挥着重要作用。在0 d，优势腐败菌属（相对丰度＞1%）有假单胞菌属、链霉菌属、希瓦氏菌属、梭菌属、鞘氨醇单胞菌和黄杆菌属等，3 d增加了不动杆菌属、苯基杆鞘氨醇菌属和食酸菌属；6 d仅存在假单胞菌属、链霉菌属、希瓦氏菌属和梭菌属；9～15 d假单胞菌属和希瓦氏菌属占比分别超过86.40%和12.24%，成为最优菌属。

总体而言，在冷藏期间变化较大的菌属主要有假单胞菌属、链霉菌属、希瓦氏菌属，其中链霉菌属仅在前6 d占比较大，而9 d后比例迅速下降直至消失；希瓦氏菌属在6 d开始迅速增长，在第9天达到最大比例，随后逐渐减少；假单胞菌属冷藏初期的比例较低，在后期占据比例超过86.40%，成为优势腐败菌。综上表明，菊黄东方鲀在0 ℃冷藏过程中存在着复杂的菌群变化，且随着冷藏时间的延长，腐败微生物种类更趋于集中单一化，在冷藏末期分离纯化得到的优势腐败菌为假单胞菌属和希瓦氏菌属。

3 优势腐败菌的分离、鉴定

从冷藏菊黄东方鲀末期共筛选出10株菌，分别命名为J1、J2、J3、J4、J5、J6、J7、J8、J9、J10，其菌落形态大多表现为光滑、边缘整齐、隆起、易挑起，但是菌落大小不一， 颜色有白色和淡黄色的区别。以1.70%琼脂糖凝胶电泳检测菌落纯度，如图7所示，各菌株均出现了单一条带，显示PCR扩增较成功，可以用于后期测序。

所得序列进行BLAST分析，选取同源性超过99%的菌株序列构建系统进化树。图8所示即为最高相似度菌种名称及其登录号，10株菌株分别是波罗的海希瓦氏菌（S. baltica）、哈夫尼希瓦氏菌（S. hafniensis）、希瓦氏菌属（ Shewanella sp. ）、液化沙雷氏菌 （S. liquefaciens）、维氏气单胞菌（A. veronii）、P. extremorientalis、产氮假单胞菌（P. azotoformans）、荧光假单胞菌（P. fluorescens）、杰氏假单胞菌（P. jessenii）、隆德假单胞菌（P. lundensis）。其中希瓦氏菌和假单胞菌的比例比较高，符合菌相变化规律。

4 优势腐败菌的致腐能力

如表2所示，荧光假单胞菌和产氮假单胞菌的产量因子分别为1.05×10－9 、3.05×10-10 mg/CFU，明显高于希瓦氏菌属，致腐能力更强。菊黄东方鲀冷藏期间产生的腐败菌的致腐能力由高到低依次为荧光假单胞菌、产氮假单胞菌、哈夫尼希瓦氏菌、波罗的海希瓦氏菌。该实验结果与倪荣和于淑池等的研究结果相似。

结 论

根据0 ℃冷藏过程中菊黄东方鲀鱼肉的TVC和TVB-N值测定结果，得出其冷藏终点为5 d。利用高通量测序技术对菊黄东方鲀冷藏期间鱼肉的菌相变化进行研究，发现鱼肉在冷藏初期菌群多样性指数高，而冷藏末期菌属较为单一，假单胞菌属和希瓦氏菌属占比 较大，故将其判定为菊黄东方鲀冷藏期间的优势腐败菌，其中假单胞菌属比例远高于希瓦氏菌属，是导致鱼体腐败的主要腐败菌。

通过传统培养基法对菊黄东方鲀冷藏末期的腐败菌进行分离纯化，共筛选出10株菌株，经16S rDNA测序技术鉴定为假单胞菌属和希瓦氏菌属，符合菌相变化规律，进而验证高通量测序结果的准确性，并对常见几种菌进行致腐能力分析，发现荧光假单胞菌的致腐能力最强，产氮假单胞菌次之，最弱的哈夫尼希瓦氏菌和波罗的海希瓦氏菌，二者致腐能力相当。本研究旨在为靶向抑菌、延长菊黄东方鲀的货架期提供理论依据。

本文《基于Illumina MiSeq测序技术探究冷藏菊黄东方鲀菌群演替规律 》来源于《食品科学》2023年44卷第18期149-156页，作者： 曾鹭，刘淑集，陈 晓婷，林河通，刘智禹 。DOI: 10.7506/spkx1002 -6630-20221108-082 。点击下方 阅读原文 即可查看文章相关信息。

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实习编辑；宁波大学食品与药学学院 俞逸岚；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。