闫建斌与雷晓光团队共同解析紫杉醇生物合成关键酶

紫杉醇在抗癌药界的地位已经毋庸置疑，然而长期以来，紫杉醇供应短缺的问题却难以解决。紫杉醇仅存在于红豆杉中，含量极低。而目前常用的合成法为半化学合成法，即从其他植物中提取紫杉醇前体化合物 baccatin III 或 10-deacetylbaccatin III，再进一步合成紫杉醇，不过这种方法的产量仍然有限。

1 月 26 日，中国农业科学院深圳农业基因组所闫建斌团队与北京大学雷晓光团队共同在Science期刊发表最新研究。

本次研究中，研究者在前期绘制的高质量红豆杉基因组的基础上，揭示了此前紫杉醇生物合成途径中的两种未知酶类，即催化紫杉醇氧杂环丁烷形成的 TOT1 和负责 C9 位紫杉烷氧化的 T9αH1。并且重新阐述了植物含氧三元环和含氧四元环结构的形成机制。

在此基础之上，研究者在烟草植物中实现了紫杉醇生产前体 baccatin III 的异源生物合成。总体而言，本次研究解决了紫杉醇生物合成的世纪难题，基于合成生物学技术打破了紫杉醇可持续生物制造的关键瓶颈。

（来源：Science）

自 1971 年首次确定了紫杉醇结构以来，研究人员长期致力于进一步探索其生物合成途径。迄今为止，已经有约 20 步酶促反应被报道。反应步骤中包括三个关键过程，即由底物香叶基焦磷酸（GGPP）形成携带 4(20)-烯-5α-醇结构单元的紫杉烷骨架，基于 C4 和 C20 双键的环氧化反应合成 baccatin III，以及将苯基异丝氨酸链连接到 baccatin III 的 C13 位置生成紫杉醇。

其中，C13 侧链的形成以及利用 baccatin III 生成紫杉醇的过程已经逐渐明晰，但形成 baccatin III 的几个基本步骤仍然未知，特别是负责氧烷环形成和 C9 氧化的通路酶尚未明确。受此限制，紫杉醇生物合成的上下游步骤便无法连接，生物合成紫杉醇成为领域内的重大难题之一。

为了解决上述问题，闫建斌课题组在 2021 年率先绘制出国际首张染色体级别的南方红豆杉高质量参考基因组图谱。该研究揭示了红豆杉独有的紫杉醇生物合成相关基因家族，为紫杉醇生物合成途径的解析提供了基因组学蓝图和关键候选基因。

而在本次研究中，研究团队基于紫杉醇生物合成相关基因家族与紫杉烷分子结构分析，通过多基因高效筛选技术进行了大量筛选和验证实验，最终从 58 个关键候选基因中发现了能够催化氧杂环丁烷合成的细胞色素 P450 酶，并将其命名为 TOT1（Taxane Oxetanase 1）。

TOT1 属于红豆杉特有的 CYP725A 蛋白亚家族，在红豆杉细胞中敲低该基因能够显著降低 baccatin III 和紫杉醇的生物合成。

研究者进一步揭示，环氧化物和氧杂环丁烷都可以通过 TOT1 酶中的羰基离子中间体（Int1）产生，但根据能量和动力学数据来看，氧杂环丁烷无疑是优势产物。这一结果改变了研究者此前对于该结构生成机制的传统认知。

在一些早期研究中，研究者普遍猜测 4(20)-烯-5α-基乙酸酯分子结构（简称双键结构）首先经环氧化生成 4(20)β-环氧-5α-乙酰氧基三元环中间体，然后通过重排反应生成氧杂环丁烷四元环。

然而本次研究的结果表明，TOT1 并不能催化三元环中间体向四元环的转变，而是将双键结构同时转变为三元环和四元环，这就说明环氧化物并不是形成氧杂环丁烷的必要中间体。

▲图丨TOT1 介导的氧化反应能量曲线（来源：Science）

对此，来自马克斯普朗克化学生态研究所的天然产物生物合成系主任Sarah O'Connor评价道，“关键的氧杂环丁烷环状结构的形成机制一直存在争议，而该发现回答了这一长期存在的问题。”

另一方面，研究团队构建了紫杉素的生物合成植物底盘，并结合生物信息学候选基因分析从 17个候选基因中筛选出了负责紫杉烷 C9 位氧化的酶 T9αH1（Taxane 9α hydroxylase 1）。T9αH1 酶的成功表征补齐了 baccatin III 的完整生物合成途径。

在此之后，研究团队利用人工异源合成途径构建策略，将新鉴定的 TOT1、T9αH1 与其他 7 个已知的合成相关基因（TXS, T5αH, T13αH, T2αH, T7βH, TAT 和 TBT）组合在一起，在烟草植物底盘中构建生物合成途径并且成功生成了 baccatin III。

▲图丨baccatin III 的生物合成过程（来源：Science）

上述结果表明，在烟草植物中可以通过表达 TOT1、T9αH1 等 9 个核心基因合成 baccatin III。然而，该过程中可能存在未知的副产物，因此 baccatin III 的产量并不高（~50 ng/g）。研究者对此表示，接下来其将针对于当前合成途径展开进一步优化，从而提高产量。

总体而言，该研究结合多组学分析和大量功能验证，成功鉴定了紫杉醇生物合成途径的关键缺失酶，揭示了植物细胞催化氧杂环丁烷结构形成的全新机制，并通过 9 个酶在植物底盘中实现了紫杉醇前体 baccatin III 的生物合成，为未来紫杉醇的大规模生产奠定了基础。

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