大连化物所模块化圆红冬孢酵母合成α-萜品醇，最高效价1.5mg/L

松油醇，别名萜品醇，是一种重要的香料，天然存在于多种精油中。松油醇工业上以松节油为原料制得，是一种混合物，以 α-萜品醇为主。具有紫丁香花香，稀释后呈榜子香味，价格低廉，是合成香料中产量较大的品种之一，广泛应用于配制日用和食用香精。

由于最终纯化产品的产量低且成本极高，植物源萜类化合物面临可持续性挑战；由于其复杂的结构，萜类化合物的化学合成具有挑战性。代谢工程技术的快速发展以及应用于微生物宿主的最新合成生物工具为上述有关成本效益和产量的可持续性问题提供了另一种方法。

近日，来自大连化物所赵宗保团队通过工程化改造产油酵母圆红冬孢酵母（Rhodotorula toruloides）合成 α-萜品醇，达到了 1.5 mg/L 的最高产物效价，揭示了圆红冬孢酵母作为合成 α-萜品醇以及其他单萜化合物的宿主平台的潜力。

赵宗保主要从事生物转化技术、合成生物技术和化学生物学研究，代表性研究内容包括：微生物油脂技术及生物质炼制、产油酵母系统生物学及其工程化改造、非天然辅酶及能量代谢工程等。已在Nature, Nat. Chem. Biol., Nat. Commun., J. Am. Chem. Soc.和Bioresour. Technol.等学术刊物上发表论文 280 余篇，授权发明专利 60 余件。

α-萜品醇是一种广泛存在于天然来源中的异构体。与其他单萜类化合物一样，α-萜品醇在香精香料行业中具有应用。在过去几年中，已发表的数据表明这种化学物质与多种生物特性相关，包括抗菌、抗氧化、抗炎、抗癌和抗惊厥作用。

萜类化合物是最多样化的一类有机化合物，包含 70,000 多种不同的分子，具有更广泛的生物功能。几乎所有萜类化合物最常用的两种前体是二甲烯丙基焦磷酸 (DMAPP) 和异戊二烯焦磷酸 (IPP)，它们通过甲羟戊酸 (MVA) 途径或 1-脱氧-D-木酮糖 5-磷酸 (DXP) 途径合成。

圆红冬孢酵母是一种产油酵母，本身拥有甲羟戊酸途径，其具有强大的脂质代谢机制，可驱动脂质生产的碳通量。由于木质纤维素原料的良好消耗，圆红冬孢酵母已成为生物炼制和合成生物学中有前途的宿主。近年来，这种酵母经过改造，可生产萜类化合物，包括单萜（柠檬烯等）、倍半萜（红没药烯等）和二萜（对贝壳杉烯等），滴度范围为 mg/L 至 g/L。

为了获得具有合成 α-萜品醇能力的圆红冬孢酵母工程菌株，研究人员实施模块化工程策略。

首先将来自葡萄的 α-萜品醇合酶（aTS ）基因整合到圆红冬孢酵母基因组中，以该改良菌株为基础，调整了三个模块化途径：增强前体供应、阻断下游途径和破坏竞争途径，以优化 α-萜品醇合酶的生产。aTS 或其他单萜合酶介导的催化是主要的限速步骤之一。

在前体供应增强模块中，共表达两个基因：tHMG1（3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶）和 ERG20ww（双功能 FPP 合酶突变体），有助于酵母单萜生产；在下游通路阻断模块中，利用 CRISPR/Cas9 系统敲除编码八氢番茄红素脱氢酶的 CRT 基因；在竞争途径破坏模块中，敲除脂滴结构蛋白，即 perilipin（Ldp1），该策略基于研究团队此前的研究，研究表明通过敲除 LDP1 基因可以减少脂质积累并提高类胡萝卜素的产量。

▲图 | 用于 α-萜品醇生产的圆红酵母模块化工程。①、②和③分别代表前体供应增强、下游途径阻断和竞争途径破坏的模块（来源：上述论文）

结果显示，在相同条件下，工程菌株 11aTS-6 比 11aTS-5 产生更多的 α-萜品醇。然而，整合外源基因后，11aTS-6 菌株在连续菌株工程实验中未能发育成功。基因组步移结果显示，aTS 表达盒插入丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因的外显子中，其在人类和酵母的内吞作用中发挥核心作用。据推测，该基因的破坏可能在异常细胞分化中发挥作用。

选择 11aTS-5 菌株继续模块化改造，结果发现，各模块中的最佳菌株 5HE2、5C2 和 5L6 的 α-萜品醇含量分别实现了 0.8、1.2 和 2.5 倍的增加。表明充足的前体供应和 α-萜品醇合成途径中大量且连续的碳源增量较为重要；还表明减少脂质积累是单萜 α-萜品醇合成的有效策略。

研究人员也采用组合策略来进一步提高 α-萜品醇产量。通过组合模块①③和模块②③发现：Ldp1 和 Crt 的失活未能增加 α-萜品醇产量；但在 ldp1Δ 菌株或 crtΔ 菌株中表达 tHmg1 和 Erg20ww可以进一步提高 α-萜品醇含量。

使用摇瓶法发酵使用各种策略创建的三种具有最大 α-萜品醇含量的工程菌株：5HE2、5C2HE2 和 5L6HE5。

为了评估延长培养时间对增强产物积累的功效，培养时间从 96 小时增加到 144 小时。实验结果表明，葡萄糖在 120 小时内完全代谢，在此阶段，α-萜品醇的含量随着时间的推移而增加。5C2HE2 和 5L6HE5 与菌株 5HE2 相比表现出更高的产物积累；另一方面，当培养时间延长至 144 小时时，α-萜品醇含量下降。定量分析表明，在 5C2HE2 和 5L6HE5 中观察到的 α-萜品醇的最大含量分别为 0.20 和 0.17mg/g DCW。

▲图 | 工程菌株的发酵性能（来源：上述论文）

总而言之，这是首次在圆红冬孢酵母中合成 α-萜品醇的研究，工程菌株 5L6HE5 具有竞争性途径破坏和底物供应增加的特点，达到了 1.5 mg/L 的最高产物效价，表明减少脂质积累是圆红冬孢酵母工程中萜类化合物合成的有效方法。这项研究揭示了圆红冬孢酵母作为合成 α-萜品醇以及其他单萜化合物的宿主平台的潜力。

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