2024年首篇！刘如谦团队合作取得新进展

先导编辑可以精确安装基因组替换，插入和删除在生命系统中。然而，高效地在体外和体内递送先导编辑组件仍然是一个挑战。

2024年1月8日，博德研究所刘如谦（David R. Liu）团队在Nature Biotechnology在线发表题为“Engineered virus-like particles for transient delivery of prime editor ribonucleoprotein complexes in vivo”的研究论文，该研究报道了先导编辑器工程病毒样颗粒(PE-eVLPs)，它可以传递先导编辑蛋白、先导编辑向导RNA和作为瞬态核糖核蛋白复合物的单向导RNA。

与基于先前报道的碱基编辑器eVLP架构的PE-eVLP结构相比，该系统地设计了v3和v3b PE-eVLPs，其在人类细胞中的编辑效率提高了65至170倍。在两种遗传性失明小鼠模型中，单次注射v3b PE-eVLPs导致视网膜中与治疗相关的先导编辑水平，蛋白质表达恢复和部分视觉功能恢复。优化后的PE-eVLPs支持先导编辑核糖核蛋白在体内的瞬时递送，通过减少脱靶编辑和消除致癌转基因整合的可能性，提高了先导编辑的潜在安全性。

在目前的基因组编辑系统中，在体外和体内的分裂和非分裂的哺乳动物细胞中，先导编辑提供了不同寻常的多功能性，它可以用几乎任何其他指定的序列替换目标DNA序列，其中包含多达数百个插入、删除或替换的碱基对。这种多功能性使得PE系统在治疗广泛的人类遗传疾病方面特别有希望。先导编辑(PE)是一种工程蛋白，由催化受损的可编程缺口酶结构域(如Cas9缺口酶)融合到工程逆转录酶(RT)结构域组成。先导编辑向导RNA (prime editing guide RNA, pegRNA)指定目标原间隔序列，同时在pegRNA 3 '延伸段的逆转录模板中编码所需的编辑。先导编辑的机制需要三个独立的核酸杂交事件才能进行编辑，不依赖于双链DNA断裂或供体DNA模板。由于这种机制，先导编辑本质上抵抗脱靶编辑或旁观者编辑，并且可以进行很少的插入缺失标记副产物或双链DNA断裂的其他不希望的后果。

要充分实现先导编辑在哺乳动物研究或治疗应用中的潜力，需要能够将PE输送到体内组织的安全有效的方法。到目前为止，一些研究小组已经报道了通过病毒递送方法在体内给药PE，包括腺病毒和腺相关病毒(AAV)。然而，病毒传递方法要求转基因直接在病毒基因表达盒中编码，限制了转基因的大小。AAV基因组具有约4.7 kb的载货基因大小限制(不包括反向末端重复序列)，需要将大型载货如PE(第一代PE的基因大小为6.4 kb)拆分为多个AAVs，限制了编辑效率，特别是在中等或低载体剂量。病毒传递方法也存在潜在的安全风险，包括持续的转基因表达增加了脱靶编辑，以及不需要的货物DNA整合到宿主细胞基因组的可能性。非病毒递送方法，如脂质纳米颗粒，通过将编辑器包装为瞬时表达信使RNAs(mRNAs)来避免这些问题。然而，尽管最近针对造血干细胞的研究取得了进展，但活体非病毒靶向肝脏以外的组织进行有效的治疗性基因编辑仍然是一个挑战。

pegRNA和ngRNA工程（图源自Nature Biotechnology）

病毒样颗粒(VLPs)是一种潜在的有前途的递送工具，原则上具有病毒和非病毒递送方法的主要优点。VLPs是由逆转录病毒多蛋白的自发组装和出芽形成的，逆转录病毒多蛋白封装了来自生产细胞的货物分子。VLPs缺乏包装的基因组，但保留了转导哺乳动物细胞和释放货物的能力。先前的研究探索了用于递送Cas9 nuclease的VLPs。最近报道了腺嘌呤碱基编辑器(ABE)的高效体内递送：单向导RNA (sgRNA)核糖核蛋白(RNPs)与迭代工程病毒样颗粒(eVLPs)克服了货物包装、释放和定位中的特定分子瓶颈。

该研究报道了一种PE-eVLPs系统的开发，该系统提供完整的PE系统，包括pegRNAs和nicking sgRNAs (ngRNAs)作为RNPs。在优化的BE-eVLP系统中，简单地将碱基编辑器(BEs)替换为PEs，产生的先导编辑系统的功能递送非常低(在培养的哺乳动物细胞中编辑效率<1%)。通过系统地识别PE-eVLP传递瓶颈并设计相应的解决方案，开发了第三代v3 PE-eVLP，与小鼠神经- 2a (N2A)细胞中的v1 PE-eVLP相比，其初始编辑效率提高了79倍，在人HEK293T细胞中提高了170倍。在小鼠模型中，单次视网膜下注射v3 PE-eVLPs显示出有效的体内先导编辑，在rd6小鼠视网膜变性模型中纠正Mfrp中4 bp的缺失(平均效率为15%)，在rd12模型中纠正Rpe65替代以部分恢复视觉功能(平均效率为7.2%)。该研究建立了PE-eVLP作为一种无病毒的方法，以RNP形式在体内递送引物编辑系统。

https://www.nature.com/articles/s41587-023-02078-y