最熟悉的陌生人 | 高通量PCR，不一样的PCR（二）

提到PCR，生物相关领域的人对此都不会陌生，但是，什么是高通量PCR？

上一篇文章（链接：最熟悉的陌生人 | 高通量PCR，不一样的PCR（一）-概念篇）讲到：要建立高通量PCR技术，首先在实验技术上要解决非特异性扩增的问题，其次要在数据分析上解决荧光判读的问题。简单来说，就是通过特殊设计的引物避免非特异性扩增；同时通过多荧光编码系统实现多阶信号读取，提升了两个数量级的检测信号。

01先看根基，dPCR的检测通量有多少？

基于PCR的检测技术在临床应用中具有显著优势，如检测周期短和检测成本低等，但相对于NGS等高通量技术来说单次检测可提供的信息量有限。qPCR平台过去只能以一种荧光标记对应一种检测靶点的方式提供信息，最终能检测的靶点数受限于仪器硬件的性能，一般只有3-5重。近几年出现多种在qPCR平台上通过结合熔解曲线等检测维度提高检测信息通量的方法，可将单反应检测靶点数提高到数十个的水平。

相比而言，dPCR平台最初可支持的信号通量与qPCR接近，仅支持数重。近几年同样出现了通过在单色通道内同时区分强阳、中阳、弱阳信号从而实现单通道三重检测，将dPCR的检测通量也提升至数十重。这表明dPCR平台同样有实现多重靶点检测的潜力。而相比qPCR，dPCR每个反应单元中的扩增都是独立进行的，基于扩增模板的充分稀释，dPCR的每个反应单元都相当于是一个单重反应，实现多重靶点检测的复杂度比qPCR更低，在多重检测方面上限更高。

那么在已经获得“练功心法”的基础上，还需要“打通任督二脉”，想要打通在一个PCR体系里同时进行多对引物扩增的“任督二脉”，就是解决非特异性扩增以及多重信号区分的问题。

02高通量PCR如何跑通流程？

基于技术优化和创新，普济生物研发出了提高PCR检测信息量的新一代解决方案：万重®高通量PCR临床诊断解决方案。万重®高通量PCR临床诊断解决方案主要由两项核心系统组成，多靶标高通量检测试剂系统和高通量PCR仪器系统。高通量PCR仪器系统又分为高通量PCR硬件平台和高通量PCR算法解决方案。这些核心技术对应分子诊断三大基本要素：分子扩增、信号检测和数据分析，普济生物针对每个基本要素都进行了优化升级。

① 更高特异性的分子扩增

PCR技术的一个棘手问题是非特异性扩增。非特异性扩增会导致检测准确性下降和扩增的靶点数的限制。单纯通过增加管数来提升检测靶点数会导致样本被稀释，影响液体活检等稀有样本的检测准确性下降，同时也会导致检测成本上升。针对多重信号检测的需求，普济生物针对引物设计和扩增体系进行了一系列优化。

实验结果证明，使用普济高通量PCR试剂的阴性对照经过多次扩增后，不会发生由引物本身引起的非特异扩增。解决了非特异性扩增的问题，单分子模板有效检测的同时支持液体活检之类的模板稀少样本检测，可以实现在单反应体系中同时进行多靶点的检测，这样一方面降低了临床检测的成本，一方面避免稀释样本从而进一步提高检测灵敏度。

传统PCR试剂与普济高通量PCR试剂非特异性扩增测试结果对比

② 多色多阶的荧光信号读取

如同使用不同深浅的颜色来区分信号一样，普济生物在方法中借鉴了前面所提到的dPCR单通道多重检测技术。如果分析模块能够在强阳、中阳、弱阳基础上进一步分辨出相同颜色但强度不同的信号，譬如我们可以看清楚浅颜色和深颜色一样，那么在已有的多通道检测基础上就可以大幅度增加可以检测的信号数量。

普济生物开发的高通量PCR仪器平台，在多荧光通道的基础上，支持多色多阶荧光信号区分，最多可实现单通道不同强度扩增信号的有效区分，最终通过荧光信号的组合就可以实现单次检测靶点数的大幅提升。而对每个反应单元进行单独检测和分析，就要尽量使相同靶点的扩增效率与信号强度一致，同时减少荧光通道之间的串扰，而这些种种则都需要在仪器平台上进行优化设计。

色彩的明亮程度的差异可以使同一个颜色标记不同的待测位点

③ 自动解码的数据分析

为了有效区分大量不同的扩增信号，普济生物研发出一种结合多通道信号的自动化数据分析算法。该算法方案可以自动化处理阅读所得到的反应单元多色多阶信号，通过解码分析，自动化区分多色多阶信号，无需人工圈选，可以自动生成对应试剂的检测分析报告，便于临床解读。借助这项技术，不仅能减少结果分析的工作量，还能有效降低因人工操作引起的干扰和误差。

03亮剑比武高通量PCRVSothers

随着人们对疾病相关分子机制的了解逐渐加深，临床症状背后对应的分子标志物越来越复杂。分子检测在追求更多检测位点的同时，也在追求更准确的疾病诊断价值，比如病原体检测从mNGS向tNGS的转变，同样是基于对检测结果的临床意义有效性的考量。

如果说tNGS具有病原谱范围明确、测序成本低等优势，那么高通量PCR在这些优势基础上还能够实现更及时高效的临床检测，以及更简便易用的分析解读。而在肿瘤早筛领域，高通量PCR相比qPCR具有检测灵敏度高和多基因多靶点检测的优势，相比NGS又具有检测成本的优势，更适合大规模人群筛查。类似的分子检测需求在其他研究领域同样适用，例如肿瘤靶向用药检测、NIPT检测、定制化家系遗传风险评估等。

高通量PCR技术可覆盖多个领域的检测需求

高通量PCR是一项兼具检测靶点高信息通量、检测快速、绝对定量、高灵敏度、高度自动化、使用简便的分子检测创新技术，该技术通过单一反应体系，实现对目标核酸的多位点精准检测和自动化分析。新技术只有与临床的实际“问题”深度结合并转化为产品，才能解决现实中临床端的使用需求。

那么，高通量PCR可以在哪些领域实现有效地产品转化？敬请关注下一篇: 高通量PCR应用解读！