魏炜研究员/马光辉院士，最新Nature！

可吸入干粉新冠疫苗

COVID-19是由SARS-CoV-2引起的一种严重急性呼吸系统综合症，于2020年被宣布为大流行。疫苗接种是成功预防和控制该疾病传播的公共卫生干预措施。迄今为止，已批准多种类型的SARS-CoV-2疫苗，包括灭活疫苗、蛋白亚单位疫苗、mRNA疫苗和病毒载体疫苗。这些疫苗大多通过肌肉注射给药，诱导产生血清学IgG，从而中和病毒的传染性并缓解COVID-19的症状。然而，由于肌肉注射疫苗无法在气道粘膜组织中诱导免疫反应，而正是这些组织是SARS-CoV-2进入的部位，因此在分泌型IgA和IgG方面存在不足。此外，目前的COVID-19疫苗需要在低温“冷链”条件下制造、运输、储存和管理，增加了成本。

在此，中国科学院过程工程研究所魏炜研究员/马光辉研究员联合北京生物技术研究所病原与生物安全国家重点实验室王恒樑研究员和朱力副研究员共同开发了一种可吸入的单剂量干粉气雾剂SARS-CoV-2 疫苗，它能诱导有效的全身和粘膜免疫反应。该疫苗将包含蛋白质霍乱毒素 B 亚基的组装纳米颗粒封装在最佳空气动力学尺寸的微胶囊中。这种独特的纳米-微型耦合结构支持高效的肺泡输送、抗原持续释放和抗原呈递细胞摄取，这些都是诱导免疫反应的有利特征。此外，这种疫苗还能诱导产生强大的 IgG 和 IgA，以及局部 T 细胞反应，从而在小鼠、仓鼠和非人灵长类动物身上共同产生针对 SARS-CoV-2 的有效保护。最后，作者还展示了一种马赛克迭代疫苗，该疫苗可同时显示祖先抗原和奥密克戎抗原，从而扩大了抗体反应的广度，以抵御共同流行的毒株和奥密克戎变种的传播。这些研究结果支持将这种吸入式疫苗用作抗击 COVID-19 和其他呼吸道传染病的多价平台。相关成果以“Inhaled SARS-CoV-2 vaccine for single-dose dry powder aerosol immunization”为题发表在《Nature》上，第一作者为Tong Ye，Zhouguang Jiao, Xin Li, Zhanlong He为共同一作。

R-CNP的制造

粘膜佐剂性和 CTB 的五聚体结构域最初促使作者构建一种自佐剂纳米底盘，该底盘是通过在 CTB C 端融合三聚体形成肽实现的，随后在大肠杆菌 BL21 菌株中表达（图 1a）。通过 SpyTag（ST）-SpyCatcher（SC）生物正交系统，产生的 CNP 底盘显示出 RBD 抗原，这有利于提高抗原稳定性、APC 吸收和活化。从 SDS-PAGE 和免疫印迹分析（图 1b）可以看出，与 ST-CNP 混合后，SC-RBD 带的分子量发生了明显变化，表明共价键已经形成。透射电子显微镜显示，R-CNP 具有分散良好的纳米颗粒特征（图 1c。

R-CNP@M的设计与制备

作者采用了 R-CNP@M 的设计，将 R-CNPs 置于气动尺寸合适的微胶囊内。这样就能有效地向肺泡输送 R-CNPs 并使其持续释放，从而支持持续的抗原刺激。作者采用膜乳化法制备了多孔 PLGA 微球，通过简单的混合和温和加热介导的密封将 R-CNPs 包裹起来（图 1e）。通过微调膜孔径、渗透梯度和孔演化时间，可控制微球的粒径、孔隙率和空腔容积，从而优化 R-CNP@M 的气动尺寸并提高其封装效率。

体内生物分布和释放

作者研究了干粉吸入器（DPI）给药后其在肺部的滞留、沉积、释放和吸收情况，与 R-CNP 相比，R-CNP@M 的曲线下面积值提高了 3.5 倍，这表明 R-CNP@M 可以诱导肺部的持续抗原刺激。此外，结果还证明R-CNP@M 疫苗能有效地输送到肺泡，而且从微胶囊中释放的 R-CNP 被 APCs 内化。

图1：可吸入R-CNP@M疫苗的构建和小鼠肺部递送评估

免疫细胞的有效反应

为了研究吸入疫苗对肺部免疫反应的影响，作者在第 21 天对肺部分免疫细胞进行了单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）。scRNA-seq 数据分为九种细胞类型（图 2a）。以 APC（树突状细胞和巨噬细胞）为重点，接种组的比例和数量均有所增加。作者还评估了呼吸道中的 T 细胞反应，在下呼吸道，免疫后 21 天和 70 天 CD8+ 记忆 T 细胞的比例依次为 PBS、CNP、R-CNP 和 R-CNP@M（图 2d）。到第 70 天，R-CNP 组 CD8+ 组织驻留记忆 T（TRM）细胞的比例从第 21 天的 30.63 ± 1.24% 降至 11.06 ± 2.81%，而 R-CNP@M 组在两个取样日的比例均保持在 21% 左右，这表明持续释放有利于 CD8+ TRM 细胞的长期维持（图 2e）。

图2：小鼠接种疫苗后的免疫过程追踪

抗体反应和保护作用

作者对小鼠的抗体产生情况进行评估（图 3a）。结果显示，与两剂游离 R-CNP相比，单剂 R-CNP@M能更快、更强地提高血清中 RBD 特异性 IgM、IgG、IgG1 和 IgG2a 的抗体滴度，而 CNP 组则检测不到 RBD 特异性抗体（图 3b）。接种 R-CNP@M 疫苗的小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）中的 RBD 特异性 IgA 和 IgG 水平高于接种 R-CNP 疫苗的小鼠，而 CNP 组小鼠的 BALF 中未检测到 RBD 特异性 IgA 或 IgG（图 3c）。

作者还评估了 R-CNP@M 疫苗在仓鼠中的表现。简而言之，仓鼠通过 DPI 接种 R-CNP@M）后，高抗 RBD IgG 滴度（图 3g）以及血清和 BALF 中的高 SARS-CoV-2 中和滴度（图 3h）共同支持了全身和粘膜免疫的建立。

图3：小鼠和仓鼠中R-CNP@M对SARS-CoV-2的免疫学评估

非人灵长类动物的免疫反应

为了使疫苗更接近临床，作者用非人灵长类动物进行了实验（图 4a）。一只使用尼罗河红标记疫苗的猴子在第 14 天被安乐死，作者收集了它的肺部进行冷冻组织切片和成像。R-CNP@M 颗粒大部分沉积在肺泡中，只有少量微囊明显存在于气管和支气管中（图 4b，c）。在验证了疫苗在非人灵长类动物中的安全性后，作者研究了针对 SARS-CoV-2 的全身和粘膜反应。在血清学抗体反应方面，抗 RBD IgG 滴度在第 84 天仍大于 104，抗体质量高于第 14 天（图 4d,e）。关于 BALF 中的抗体反应，R-CNP@M 组也检测到了高滴度的 RBD 特异性 IgA 和 IgG（图 4f）。值得注意的是，血清和 BALF 样本对伪型病毒和活病毒都表现出良好的抵抗能力（图 4g、h），这进一步证实了 R-CNP@M 疫苗在有效抵御 SARS-CoV-2挑战方面的价值。

图4：R-CNP@M在食蟹猴中的表现

迭代以获得更广泛的免疫力

鉴于CNP 底盘可以显示用户选择的抗原，作者探索了共同显示野生型 RBD（RWT）和 Omicron RBD（RO）的可能性，以应对两种共循环菌株情况下的挑战。作者在自愈性微胶囊（RWTRO-CNP@M）中装入了由此产生的镶嵌型 RWTRO-CNP；并制备了 RWT-CNP@M 和 RO-CNP@M 以进行比较（图 5a）。在单剂量干粉气溶胶注射（10 µg 等效 RBD）这三种疫苗后的第 28 天评估了小鼠的预防性抗体。

RWTRO-CNP@M 疫苗对野生型毒株和 Omicron 变异株的伪病毒中和效果良好，而用 RWT-CNP@M 或 RO-CNP@M 免疫的小鼠血清不能中和未配对毒株的伪型病毒。对于 BALF 样本，IgA 和 IgG 滴度也观察到类似的结果，RWTRO-CNP@M 组能有效中和两种毒株的伪病毒，而 RWT-CNP@M 组和 RO-CNP@M 组则不能（图 5d、e）。因此，抗原-CNP@M 的马赛克迭代设计可以扩大抗原诱导抗体反应的广度，这将有助于管理未来多种变体共循环的情况。

图 5：镶嵌 R-CNP@M 的免疫学评估及其抗 SARS-CoV-2 传播的性能

【小结】

总之，本文开发了一种可吸入、单剂量、干粉气溶胶 SARS-CoV-2 疫苗。微胶囊合适的空气动力学直径有利于在肺泡中的沉积，并且释放的纳米级 R-CNP 很容易被 APC 内化。作者的疫苗诱导血清中 IgG 的强劲长期产生和 BALF 中丰富的 IgA 的产生，并对小鼠、仓鼠和非人灵长类动物产生有效的保护。通过马赛克迭代，作者成功地扩展了血清和粘液中 RBD 诱导的抗体反应的广度。考虑到在 CNP 底盘上展示抗原的灵活性，作者设想作者的吸入疫苗可以作为对抗 COVID-19 和其他呼吸道传染病的有前途的多价平台。

来源：BioMed科技

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