柑橘沙皮病研究进展

柑橘沙皮病研究进展

黄 峰等

柑橘属于芸香科（Rutaceae）柑橘属（Citrus），是全球范围内最广泛栽培的大宗水果之一。我国是世界上最大的柑橘生产国，柑橘的种植面积接近 4000 hm 2 ，总产量超过 4500万吨 。在种植规模不断扩大的同时，保障我国柑橘产业科学健康的发展，提升果实的品质和外观也越来越受到重视 。柑橘沙皮病是目前柑橘上最为重要的真菌性病害之一 ，该病害能够为害几乎所有的栽培柑橘品种，侵染柑橘枝干、叶片和果实都能够产生病斑。柑橘沙皮病在果实上产生的黑点和沙皮病斑严重影响果实的外观品质，降低果实的鲜销价格，对于柑橘产业的影响最大 。目前，对于柑橘沙皮病的防治主要是采用农业防治与化学防治相结合的方法 ，生物防治近年来开始受到关注，主要集中在柑橘沙皮病病菌拮抗菌的筛选和有效成分的试验 ，而抗病品种目前还较为稀缺。本文主要对柑橘沙皮病的病原、典型症状、发生情况、为害机理和发生规律进行概述，并对柑橘沙皮病的农业防治、物理防治、化学防治和生物防治方法进行归纳总结，以期为柑橘沙皮病的科学防控提供借鉴。

1 柑橘沙皮病症状与病原多样性

1.1 症状多样性

柑橘沙皮病，或称柑橘树脂病、砂皮病、黑点病，是间座壳属（Diaporthe）真菌在柑橘上引起的一系列病害症状的统称 。在果园中比较常见的是在柑橘叶片、嫩梢和果实表面，为害后产生的散生或密集成片的褐色、黑褐色硬胶质小粒点（图 1A-C）；严重时，果面粗糙，隆起，很像黏附着许多细沙，称为沙皮病（图 1D） 。树脂病还能够造成柑橘枝干的死亡，引起枝干皮部坏死，皮层组织松软，有小的裂纹，水渍状，并渗出褐色胶液，称为流胶型（图 1E）；引起枝干病部皮层红褐色干枯，略下陷，微有裂缝，不剥落，在病健部交界处有明显的隆起线，称为干枯型（图 1F） 。在果实贮藏期，病菌从果实蒂部侵入，引起果实表面出现水渍状褐色病斑，内部白色菌丝迅速生长并形成穿心烂，称为褐色蒂腐病（图 1G-H） 。

图 1 柑橘沙皮病的症状多样性

1.2 病原菌多样性

引起柑橘沙皮病的主要病原菌为间座壳属（Diaporthe, D.）的柑橘间座壳菌（D. citri），之前比较广泛使用的名称为其无性态名称柑橘拟茎点霉菌（Phomopsis citri） 。间座壳属隶属于子囊菌门（Ascomycota），粪壳菌纲（Sordariomycetes），间座壳目（Diaporthales），间座壳科（Diaporthaceae），该属内多种真菌与柑橘属植物（Citrus spp.）的关系密切，能够以病原真菌、内生真菌和腐生真菌的形式与柑橘植物形成多样的共生关系（表 1）。作为病原真菌，柑橘上发生的多种间座壳属真菌能够侵染宽皮柑橘类、橙、柚、柠檬等不同的柑橘品种，引起多种病害症状（表 1） 。比如，柑橘间座壳菌和亚洲柑橘间座壳菌（D.citriasiana）都能够引起柑橘上的枝干死亡 ，柑橘间座壳菌、亚洲柑橘间座壳菌以及其他的 4 种间座壳属真菌（D. citrichinensis，D. passifloricola，D. siamensis，D. taoicola）都能够引起柑橘果实贮藏期的褐色蒂腐病 。根据现有的研究，柑橘间座壳菌是引起柑橘枝梢、叶片和果实上黑点和沙皮症状的唯一病原菌，是柑橘田间危害最为严重的间座壳属真菌 。

除此之外，柑橘上报道的其他间座壳属的真菌多达近 30 种（表 1）。其中，D. foeniculina作为在欧洲、美国和中东地区发生的重要病原真菌，能够引起多种柑橘品种枝干的溃烂、干枯和死亡，以及果实的腐烂 ，在我国并未有发生的报道，应该引起检疫上的重视。其他一些作为内生真菌或腐生真菌而被分离和鉴定的间座壳属的真菌，它们的致病性在分离或报道时并没有被进行接种确认，而后续的研究中被证实其中存在不少柑橘的病原真菌（比如，D. passifloricola，D. siamensis，D. sojae，D. taoicola，D. unshiuensis） 。比如早在 2015 年，D. sojae 被作为柑橘健康枝干的内生菌和带有疮痂病斑叶片的腐生菌被报道 ；到 2022 年，该菌被证实能够引起脐橙在储存期间的褐色腐烂 。因此推测，柑橘上发生的内生和腐生间座壳属真菌，可能作为潜在的病原真菌，在环境条件适宜和柑橘树势衰弱的情况下能够发生侵染和致病。

1.3 柑橘间座壳菌的检测

鉴于柑橘上发生的间座壳属真菌非常多样，而且不同的间座壳属真菌在培养性状和形态学特征上难以区分，Chaisiri 等（2020）和曾雅婷等（2022）根据间座壳属真菌 β-微管蛋白（β-tubulin）基因序列上的差异，分别设计了用来检测柑橘间座壳菌的特异性引物对 。Chaisiri 等（2020）设计的引物对 TUBDcitri-F1/TUBD-R1，采用普通 PCR 对柑橘间座壳菌的 DNA 进行检测，检测目标扩增片段 217 bp，检测灵敏度能够达到 10 ng/µL 的基因组DNA 。相比之下，曾雅婷等（2022）设计的引物对 Dc-F/Dc-R，采用 SYBR Green I 实时荧光定量 PCR 对柑橘间座壳菌的 DNA 进行检测，检测目标扩增片段 244 bp，检测灵敏度能够达到 0.35 ng/µL 的基因组 DNA 。另外，Choi 等（2021）则根据柑橘间座壳菌与 D.cytosporella、D. foeniculina，以及柑橘上其他属的常见病原真菌在核糖体转录间隔区（internaltranscribed spacer, ITS）的差异，设计了引物对 DcitriF/DcitriR 并利用普通 PCR 检测柑橘间座壳菌在培养条件下和活体组织上的存在 。然而，在他们的研究中，并没有考虑柑橘上多种间座壳属内生和腐生真菌在 ITS 序列上的相似情况，因此引物对检测的有效性还有待确认 。在后续的研究中，应该对多样的检测方法进行应用试验和推广。

2 柑橘沙皮病为害现 状

柑橘沙皮病最早于 1892 年在美国佛罗里达州报道，之后于 1912 年经 Fawcett 分离并鉴定为由柑橘拟茎点霉菌引起 。经过一个来世纪，该病害已经遍布世界各大柑橘产区，比如亚洲的日本、印度，南美洲的巴西，大洋洲的澳大利亚等国家。在我国，柑橘沙皮病广泛发生于广东、广西、江西、湖南、福建、浙江等柑橘产区，主要为害包括椪柑、脐橙、温州蜜柑、贡柑、本地早、沙田柚和琯溪蜜柚在内的主要柑橘品种 。同时，柑橘沙皮病也能够为害柑橘近缘属植物金橘，在金橘产区造成一定的影响 。虽然只有在病害发生较为严重的情况下，柑橘沙皮病才能对柑橘植株造成毁灭性的伤害，但是因为其轻微发生的情况下，能够在柑橘果实表面形成褐色或黑褐色硬质小粒点，严重影响了果实的外观，降低了消费者的购买欲，从而使其商品价值大为减损。

3 柑橘沙皮病的 致病机理 和为害规律

3.1 致病机理

在保证温度适宜（24~28 ℃）的情况下，充足的湿润条件是柑橘间座壳菌成功侵染的关键 。柑橘间座壳菌在柑橘组织表面的潜伏期可长达 4~7 天，期间需要保存 8~24 小时的水分才能够成功完成侵染 。病原菌在幼嫩的叶片、枝条和果实表面的侵染成功率较高，而在较为成熟的柑橘组织中，通常难以侵入 。待病原菌侵入柑橘表皮细胞之后，寄主启动防卫反应，并通过分泌 6, 7-二氧甲基香豆素来抑制病原菌的生长 。在侵染表皮周围，3~5 层细胞发生褐化和坏死，外层细胞继续增殖和膨大，形成半球形的愈伤组织。在坏死细胞和半球形愈伤组织之间，产生周皮并形成明显的病健交界，最终形成我们肉眼可见的褐色或黑褐色硬质小粒点。

3.2 发病规律

柑橘间座壳菌是一种在柑橘上的弱寄生菌，同时也是果园中的一种腐生菌。通常，病菌以菌丝体、分生孢子器、分生孢子和子囊孢子的形式在枯枝败叶内越冬 ，在第二年湿润的条件下，大量的分生孢子从分生孢子器中分泌而出，并形成分生孢子角（图 2） 。在雨水、风力等因素的作用下，传播到新梢上的 α-型分生孢子能够萌发并形成初侵染 。据报道，柑橘间座壳菌的分生孢子在 5~35 ℃的温度范围内都能够萌发，萌发后的菌丝在 10~35 ℃的温度范围内都能够生长，一般最适生长温度为 20 ℃ 。同时，也有研究认为柑橘间座壳菌在腐烂枝干上产生的假囊壳，能够释放子囊孢子同样作为柑橘沙皮病的重要的初侵染源 。然而在果园中，柑橘间座壳菌，以及其他的柑橘上的间座壳属真菌，它们的有性态很少被观察到 。

水分对柑橘间座壳菌孢子的传播和萌发都至关重要，所以果园的降水情况与柑橘沙皮病的发生密切相关 。据许渭根等（2019）的报道，浙江省在 2011—2018 年的八年中，柑橘沙皮病的发生面积与六、七月份的梅雨期降雨量高度吻合，在柑橘生长期的雨水频繁和雨量大都能够造成病害的严重发生 。在上海地区 2010—2018 年九年的观测中，蒋飞等（2022）的报道同样如此，六月下旬的降雨量与当年柑橘沙皮病的发生情况密切相关 。低温冻害、日灼、农事操作、枝条修剪和其他病虫害发生等因素能够造成田间橘树伤口，为柑橘间座壳菌的侵染、越冬和繁殖提供便利，因此也能够影响到柑橘沙皮病的发生 。

图 2 柑橘间座壳菌的病害循环（图片由刘欣提供 51 ）

4 柑橘沙皮病防控技术研究

4.1 农业防治

目前农业防治是防治柑橘沙皮病的主要手段之一，特别是农业防治结合化学防治，是当前主要推广的柑橘沙皮病的防治方法 。柑橘沙皮病的农业防治主要在于增强柑橘植株的树势和对病原菌的抵抗力，减少果园枯枝败叶的存量，以及阻断病原菌的传播等方面 。首先，通过加强栽培管理，科学合理的修剪和施肥，以及清除果园内的竞争性杂草，可以增强橘树的生长势头，同时提高橘树对病原菌侵染的抵抗能力。其次，农事操作中尽量避免对橘树造成机械损伤，同时对一些常见的伤口，如冻伤和其他病虫害为害的伤口、嫁接口、修剪口等进行保护，也能够提高橘树对病原菌侵染的抵抗能力 。再次，及时清理果园内因修剪、农事操作和其它病虫害发生所产生的枯枝败叶，能够有效地降低果园内柑橘沙皮病病原菌的存量，防止其分生孢子在雨期随着雨水大量扩散 。最后，通过营造防护带、防护林等，能够在一定程度上减少柑橘沙皮病病原菌分生孢子的传播，达到阻断病害发生的效果 。

4.2 物理防治

针对低温冻害、日灼和连续降雨等气象灾害都能够加剧橘园柑橘沙皮病的发生，柑橘沙皮病的物理防治应该着重防护极端气候对橘树的影响 。首先，各级农业部门与气象部门紧密协作，加强对极端气候的预测预报，并及时向果农传递预警信息 。其次，果农应该充分了解当地可能发生的高低温、强光照和强降雨等极端气候，做好应急预案，在面对极端气候现象发生时，果断做出反应，尽量避免橘树的大面积损伤，以及柑橘沙皮病的伺机爆发。

比如，在一些有条件的果园，通过构建大棚，能够有效地减少橘树受到环境中高、低温和降雨的影响，从而减轻柑橘沙皮病的发生 。在果实生长期进行修剪的过程中，应该避免过度修剪顶梢，使果实裸露在强光下，造成日灼的发生。对已经有沙皮病发生的橘树，通过对发病部位（枝条）使用喷灯，从外缘向中间进行大约 30s 的灼烧，灼烧后不会再有紫褐色的胶液从腐烂部位和健康部位相接的边缘流出来即可 。

4.3 化 学防治

从上世纪八、九十年代柑橘沙皮病在国内频繁报道以来，化学防治一直是防治柑橘沙皮病最直接有效的手段 。由于柑橘沙皮病病菌主要侵染和为害橘树的幼嫩组织，因此柑橘沙皮病的化学防治关键是保护新梢、叶片和生长期的果实免受侵染 。针对柑橘沙皮病防治适期的选择应该着重考虑：在新梢萌芽前，施药降低果园中柑橘沙皮病病菌的侵染源；在新梢和果实生长到成熟期（包括萌芽期、壮果期、幼果期、落花期和着色期）持续施药防控；在雨期加强施药减少病菌分生孢子的传播。

在药剂的选择上，应该注意保护性杀菌剂与治疗性杀菌剂结合使用。早期在美国佛罗里达的药剂试验中，吡唑醚菌酯因其具有比氢氧化铜、噁唑菌酮更长的保护期，而作为比较推荐的防治柑橘沙皮病的用药 。随着柑橘沙皮病在国内的发生日益严重，越来越多的研究开始试验不同的杀菌剂在各大柑橘产区的防治效果。针对碰柑、温州蜜柑、胡柚等主栽品种发生的沙皮病，普遍推荐使用保护期长的代森锰锌 。陈国庆等（2010）发现，代森锰锌对柑橘沙皮病的田间防效要明显优于戊唑醇、苯醚甲环唑和咪鲜胺锰盐 3 种麦角甾醇合成抑制剂类的杀菌剂，这可能归功于代森锰锌对柑橘沙皮病病菌分生孢子萌发和侵染的抑制。在喷施代森锰锌的同时，使用植物油或者有机硅可以进一步提升防治效果 。刘欣等（2018）在室内实验种发现，代森锰锌混合苯醚甲环唑（4：1）可以提高对病菌菌丝生长的抑制效果，代森锰锌混合矿物油（1：1250 和 1：6250）能够提高对病菌孢子萌发的抑制效果 。吕靖雯（2018）证实代森锰锌 600 倍液（大生）混合 0.5%矿物油（绿颖）是当前最经济有效的田间沙皮病防治的药剂组合 。

除代森锰锌之外，吡唑醚菌酯也被证实对于柑橘沙皮病的防控具有良好的效果。张岳等（2018）测定了 26 种杀菌剂单剂和复配剂对柑橘沙皮病病菌的室内毒力，吡唑醚菌酯是毒力最高的治疗性杀菌剂，其 50%效应浓度值远低于代森锰锌（0.2001 对 3.3946 mg/L）；进一步将吡唑醚菌酯和代森锰锌进行混配（原药比例 1：5），发现对抑制柑橘沙皮病病菌生长的效果提升最为明显 。吡唑醚菌酯和代森锰锌组合（43%代森锰锌悬浮剂 300 倍 + 50%吡唑醚菌酯水分散粒剂 3000 倍 + 5%橙皮精油 1000 倍）的施用对田间柑橘沙皮病的发生具有显著的抑制效果 。

我国柑橘沙皮病病菌还未被检测到对代森锰锌等推荐使用的杀菌剂产生抗性，但是在刘欣等（2018）的研究中已经发现，在江西南丰和浙江衢州果园采集的柑橘沙皮病病菌种群对代森锰锌的耐性已经显著地高于野生种群 。因此，筛选针对柑橘沙皮病的高效替代杀菌剂非常重要。周娜等（2014）测定了 33 种杀菌剂对柑橘沙皮病病菌的室内毒力，发现双胍三辛烷基苯磺酸盐、氟硅唑、多菌灵、咪鲜胺锰盐、吡唑醚菌酯、苯醚甲环唑、咪鲜胺、戊唑醇、甲基硫菌灵的抑菌效果较强（50%效应浓度值 0.0112~1.7296 mg/L） 。张岳（2019）筛选出 80%代森锰锌可湿性粉剂（大生）300 倍 + 19%啶氧·丙环唑（法砣）1000 倍 + 5%橙皮精油（助剂）1000 倍的杀菌剂组合 。另外一些复配杀菌剂对于柑橘沙皮病的田间防治也取得了良好的效果，在实际应用中值得尝试和推荐。刘欣等（2018）发现百菌清和克菌丹对孢子萌发抑制效果显著优于代森锰锌，而且在温室中的防效与代森锰锌相当，苯醚甲环唑对病菌菌丝生长的抑制效果显著较好 ；张斌等（2020）发现氟啶胺对菌丝生长和孢子萌发的抑制效果均好于代森锰锌 。同时，嘧菌酯对柑橘沙皮病菌菌丝生长（50%效应浓度值 0.2285 mg/L）和孢子萌发（0.0256 mg/L）的抑制效果也非常明显，被推荐作为代森锰锌的一种补充杀菌剂 。除了克菌丹·啶氧菌酯、氟唑菌酰胺·戊唑醇对柑橘沙皮病的大田防效被进一步试验 ，其他药剂对柑橘沙皮病的田间防治效果还有待证实。

4.4 生物防治

柑橘组织和土壤中寄生的微生物是柑橘沙皮病生防菌的重要来源，筛选生防菌、提炼试验其有效的抑菌物质，是研究柑橘沙皮病病菌生物防治的主要方向 [。刘胜贵等（2016）在柑橘内生菌中筛选到 1 株解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）X17，具有很好的室内抑菌活性，同时对田间沙皮病的防治作用也较为显著 。龙兆雨等（2018）从土壤中分离得到 4 株细菌对柑橘沙皮病病菌有明显的抑菌活性，其中短小芽孢杆菌（B. pumilus）菌株 Y2 的发酵液对沙皮病菌菌丝生长的抑制作用最为明显 。李审微（2020）从 72 株健康柑橘叶片内生细菌中，筛选得到 1 株枯草芽孢杆菌（B. subtilis）M-23，该菌 10 倍、20 倍稀释的发酵液对沙皮病病菌的抑制率分别达到 72.67%和 61.80% 通过对田间柑橘多次喷施 M-23 的发酵液，柑橘沙皮病的防治效果能够达到 74% 。在生防真菌筛选方面，刘常利（2021）从柑橘园枯枝中分离得到 3 株木霉菌，棘孢木霉（Trichoderma asperellum）WLP31、Trichoderma asperelloidesWLA94 和 WL123，既具有抑制沙皮病病菌的能力，又具有降解枯枝的能力 ，意味着生防菌在田间能够直接或间接地通过对越冬场所的竞争对沙皮病病菌进行抑制。Li 等（2022）发现在柑橘沙皮病病菌侵染后，柑橘叶片中多种细菌富集并共同营造一个抑制沙皮病病菌生长的微环境，比如泛菌（Pantoea sp. asv90）和甲基杆菌（Methylobacterium sp. asv41）能够抑制病菌孢子萌发和菌丝的生长，鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas sp. asv20）通过铁元素的竞争吸收表现出对病菌的拮抗作用 。在今后针对柑橘沙皮病病菌的生物防治研究中，可以考虑采用多种细菌合成的简单的微生物群落，一方面提高对柑橘沙皮病的防治效果，另一方面通过提高群落的稳定性来延长生防菌在柑橘组织表面的存活和作用时间。

5 展望

柑橘上发生的间座壳属真菌在种类以及与寄主的共生关系上非常多样，既有多种重要的病原真菌，又有多种内生和腐生真菌 。在今后分离和鉴定间座壳属真菌的研究中，在完成形态学鉴定和基于多基因位点的系统进化分析的同时，应该注重间座壳属真菌对柑橘不同组织部位的致病性分析。从柑橘活体组织上分离的内生和腐生真菌，对于柑橘储存期果实却是病原真菌 ，可以推测潜在病原菌的存在导致间座壳属真菌在柑橘上的生活史更为复杂。虽然柑橘间座壳菌已经具有世界性的分布，但是其他柑橘上发生的间座壳属真菌具有明显的地域性发生特点，因此对于一些在国外发生的重要病原真菌，应该及时开发检测方法，在检疫上杜绝这些病原菌的输入 。

间座壳属真菌对柑橘致病或与柑橘共生的机理研究目前还非常匮乏，仅有的研究也集中在柑橘间座壳菌上。采用多组学，或者基于分子生物学的功能基因研究方法，可能是理解间座壳属真菌与柑橘寄主互作机理的最有效的方法 。特别是具有内生生活史的间座壳属真菌，它们本身具有分泌抗菌代谢物的能力，可能参与了寄主植物对其他病原微生物的免疫反应 。利用代谢组学的方法，有助于寻找和开发应用这一类的代谢物质。

最后，基于现阶段对柑橘沙皮病致病机制和发病规律的理解，对该病的防治应该遵循“预防为主、综合防治”的植保原则，加强系统的防治技术研究和推广：（1）在以农业防治为主的同时，加强药剂筛选，试验和制定不同的药剂轮换、交替使用的策略，实现药剂减量增效的目的，并减缓柑橘沙皮病病菌抗药性的产生；（2）加强对极端天气和降雨发生的预警，预防极端天气对橘树可能造成的伤害，对已发生伤害的橘树和在降雨增强期间，注意施药保护；（3）加强生物防治的研究，开发对人体无害且无污染的“绿色农药” ，对化学农药进行补充和替代；（4）挖掘抗病育种资源，通过柑橘寄主本身的免疫系统，结合育种技术实现抗病品种的选育和推广。