骨科2区：FOXO3通过NF-κB/MAPK信号通路的失活抑制铁死亡，从而减轻骨关节炎

研究背景

铁死亡是一种以脂质过氧化和细胞内铁蓄积为特征的非凋亡性细胞死亡过程。随着骨关节炎(osteoarthritis, OA)的进展，炎症或铁过载可诱导软骨细胞铁死亡。然而，在这一过程中发挥重要作用的基因仍缺乏研究。

研究发现

在体外实验中，IL-1β和TNF-α诱导ATDC5细胞或初代软骨细胞发生铁死亡。此外，铁死亡激动剂erastin和铁死亡抑制剂ferrostatin-1分别下调或上调叉头状转录因子O3 (FOXO3)的蛋白表达。这首次表明FOXO3可能调控关节软骨的铁死亡。我们的结果进一步表明，在ATDC5细胞和原代软骨细胞中，FOXO3通过铁死亡机制调节ECM代谢。此外，我们证明了NF- κB/丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号级联在调节FOXO3和铁死亡中的作用。体内实验证实了关节腔内注射过表达FOXO3的慢病毒对由erastin加重的OA的挽救作用。

我们的研究结果表明，在体内和体外，铁死亡的激活促进软骨细胞死亡和破坏ECM。此外，FOXO3可通过NF-κB/MAPK信号通路抑制铁死亡，从而减轻OA进展。

图1：炎症可以诱导ATDC5细胞发生FOXO3参与的铁死亡.图A：经IL-1β (10 ng/ml)或TNF-α (10 ng/ml)处理后24h GSH含量的测定.图B：经IL-1β (10 ng/ml)或TNF-α (10 ng/ml)处理后24h MDA含量的测定.图C：通过WB分析确定ATDC5细胞中GPX4和SLC7A11的表达水平.图D：基于WB分析的GPX4和SLC7A11表达的半定量分析.图E：Liperfluo荧光探针(比例尺:50μm)检测细胞内脂质过氧化。脂质过氧化荧光强度半定量分析.图F：Liperfluo荧光探针(比例尺:50μm)检测细胞内脂质过氧化。脂质过氧化荧光强度半定量分析.图G：不同浓度erastin处理ATDC5细胞24h后，采用WB分析法检测FOXO3、GPX4 和SLC7A11的表达.图H：基于WB分析法半定量分析FOXO3、GPX4和SLC7A11的表达.图I：不同浓度Fer-1处理ATDC5细胞24h后，通过WB分析检测FOXO3、GPX4和 SLC7A11的表达.图J：基于WB分析的FOXO3、GPX4和SLC7A11表达的半定量分析

图2：FOXO3敲低后促进ECM代谢紊乱和凋亡.图A：WB分析验证了在ATDC5细胞中3次利用lenti-sh-FOXO3敲低FOXO3的方式的成功.图B：基于WB分析的FOXO3表达的半定量分析.图C：shRNA处理的ATDC5的Alcian blue染色.图D：FOXO3 shRNA #1#2/#3慢病毒感染ATDC5s或对照组shRNA慢病毒感染ATDC5s 中MMP13, ADAMTS5和Collagen II的蛋白水平.图E：基于WB分析的MMP13, ADAMTS5和Collagen II的半定量表达.图F：FOXO3 shRNA #1#2/#3慢病毒感染ATDC5s和对照组shRNA慢病毒感染ATDC5s后BAX、cleaved-caspase-3、BCL-2和cleaved-PARP蛋白表达水平.图G：基于WB半定量分析BAX、cleaved-caspase-3、BCL-2和cleaved-PARP蛋白表达水平.图H：TUNEL染色法检测感染FOXO3 shRNA #1慢病毒和对照组shRNA慢病毒(标尺:100 μm)后的ATDC5软骨细胞的凋亡.图I：ATDC5软骨细胞ⅱ型胶原免疫荧光染色(比例尺:50 μm).

图3：FOXO3挽救了IL-1β处理引起的细胞外基质代谢紊乱和细胞凋亡图.A：WB分析验证了FOXO3在lenti-FOXO3处理的ATDC5细胞中成功过表达.图B：基于WB分析的FOXO3表达的半定量分析.图C：Alcian blue染色的lenti-FOXO3处理的ATDC5细胞.图D：FOXO3慢病毒和IL-1β (10 ng/ml)感染的ATDC5s中MMP13, ADAMTS5和 Collagen II的蛋白水平.图E：基于WB分析的MMP13, ADAMTS5和Collagen II的半定量表达.图F：FOXO3慢病毒联合IL-1β (10 ng/ml)感染ATDC5s细胞后，BAX、cleaved-caspase-3、 BCL-2、cleaved- PARP蛋白表达水平.图G：基于WB半定量分析MMP13、ADAMTS5、Collagen II蛋白表达水平.图H：TUNEL染色法检测FOXO3慢病毒和IL-1β (10 ng/ml)感染的ATDC5软骨细胞(标 尺:100 μm).图I：免疫荧光染色法检测ATDC5软骨细胞Collagen II的表达(标尺:50 μm).

图4：FOXO3抑制IL-1β诱导的ATDC5软骨细胞铁死亡.图A：感染FOXO3慢病毒和IL-1β (10 ng/ml)的ATDC5s中GPX4和SLC7A11的蛋白水平.图B：基于WB分析的GPX4和SLC7A11表达的半定量分析.图C：GPX4免疫荧光染色处理上述ATDC5软骨细胞(比例尺:50 μm).图D：GPX4荧光强度半定量分析.图E：DCFH-DA检测细胞内ROS (Up)，Liperfluo荧光探针检测细胞内脂质过氧化(Middle)，Feby FerroOrange Assay检测细胞内Fe2＋ (Down)(比例尺:50 μm)。采用MDA检测试剂盒半定量分析ATDC5细胞内ROS荧光强度.图F：脂质过氧化.图G：细胞内Fe2＋.图H和I：使用MDA检测试剂盒定量测定ATDC5细胞中MDA的水平.图J：使用GSH检测试剂盒定量测定ATDC5细胞中的GSH水平.图K：细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测法检测细胞活力.

图5：敲低FOXO3增加了ATDC5软骨细胞对铁死亡的敏感性.图A：在erastin (10 μM)，Fer-1 (10 μM)和sh-FOXO3感染的ATDC5s中GPX4, SLC7A11,MMP13, ADAMTS5和Collagen II的蛋白水平.图B：基于WB分析的蛋白表达的半定量分析.图C：GPX4免疫荧光染色处理上述ATDC5软骨细胞(比例尺:50 μm).图D：GPX4荧光强度半定量分析.图E：DCFH-DA检测细胞内ROS (Up)， Liperfluo荧光探针检测细胞内脂质过氧化 (Middle)， Feby FerroOrange Assay检测细胞内Fe2＋(Down)(比尺:50 μm)。采用MDA检测试剂盒半定量分析ATDC5细胞内ROS荧光强度（图F）脂质过氧化（图G）和细 胞内Fe2＋.图H和图I：使用MDA检测试剂盒定量测定ATDC5细胞中MDA的水平.图J：使用GSH检测试剂盒定量测定ATDC5细胞中的GSH水平.图K：细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测法检测细胞活力.

图6：Erastin通过靶向NF-κB和MAPK信号通路激活铁死亡.图A：Western blotting显示，Erastin影响NF-κB信号通路相关蛋白IKK/p-IKK、p-IκB α和P65/p-P65（A和B）和MAPK信号通路相关蛋白p-JNK/JNK、p-ERK/ERK和 p-P38/P38（D和E）。过表达FOXO3抑制Erastin激活的NF-κB (C)和MAPK (D)信号通路.图G：细胞内过表达FOXO3对NF-κB/MAPK信号通路的影响.图H：erastin (10 μM)和MAPK-IN-1 (10 μM)处理的ATDC5s中GPX4和SLC7A11的蛋白水平.图I：基于WB分析的GPX4和SLC7A11表达的半定量分析.图J：erastin (10 μM)和NF-κB-IN-1 (50 μM)处理的ATDC5s中GPX4和SLC7A11的蛋白水平.图K：基于WB分析的GPX4和SLC7A11表达的半定量分析.图L、N：MDA检测试剂盒定量检测ATDC5细胞中MDA水平.图M、O：GSH检测试剂盒检测ATDC5细胞中GSH水平.

图7：FOXO3也调节小鼠初代软骨细胞的铁死亡.图A：通过WB分析确定初代软骨细胞中GPX4和SLC7A11的表达水平.图B：基于WB分析的GPX4和SLC7A11表达的半定量分析.图C：不同浓度erastin处理原代软骨细胞24h后，通过WB分析检测GPX4, SLC7A11, Collagen II, MMP13和ADAMTS5的表达图D：基于WB分析的F GPX4, SLC7A11, Collagen II, MMP13和ADAMTS5的表达的半定量分析.图E：不同浓度Fer-1处理原代软骨细胞24h后，通过WB分析检测GPX4、SLC7A11、Collagen II、MMP13和ADAMTS5的表达.图F：基于WB分析半定量分析GPX4、SLC7A11、Collagen II、MMP13和ADAMTS5的表达.图G：FOXO3慢病毒和IL-1β (10 ng/ml)感染的原代软骨细胞中FOXO3、GPX4、SLC7A11、Collagen II、MMP13和ADAMTS5的蛋白水平.图H：基于WB分析的半定量分析FOXO3、GPX4、SLC7A11、Collagen II、MMP13和 ADAMTS5的表达.图I：Liperfluo荧光探针检测细胞内脂质过氧化(Up)， Feby FerroOrange Assay检测细胞内Fe2＋(Down)(比尺:50 μm)。采用MDA检测试剂盒半定量分析初代软骨细胞脂质过氧化荧光强度（图J）和细胞内Fe2＋（图K和L）MDA水平.图M：GSH检测试剂盒定量分析初代软骨细胞GSH水平

图8：FOXO3过表达减轻小鼠由erastin加重的OA.图A：DMM诱导的体内骨关节炎实验的时间过程示意图.图B：膝关节和骨赘(红色箭头)的micro-CT扫描重建图像（比例尺，1 mm）.图C：软骨下骨的BV/TV，骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb. Th)和骨小梁间距(Tb. n).图D：采用H&E染色和Safranin O染色和快速绿色染色，观察DMM手术下小鼠膝关 节软骨组织的细胞形态和组织完整性（比例尺，20 μm）.图E：OARSI分级评价4组软骨降解情况.图F和G：TUNEL染色法检测DMM手术小鼠膝关节软骨组织（比例尺，20 μm）.图H和K：来自sham或DMM小鼠膝关节软骨组织中FOXO3（上）、GPX4（中）和 II型胶原（下）免疫染色的代表性图像（比例尺，25 μm）；柱状图显示了在免疫组化 和免疫荧光切片中，每个区域的细胞总数中FOXO3-、GPX4-或col2阳性细胞的定量分 析.

图9：FOXO3调控铁死亡在骨关节炎发展中的作用示意图

转化意义

这项研究强调了FOXO3通过NF-κB/MAPK信号通路调控软骨细胞铁死亡在OA进展中的重要作用。通过激活FOXO3抑制软骨细胞铁死亡有望成为OA治疗的新靶点。

课题组简介

王晓庆，主任医师，博士研究生导师。国际矫形与创伤外科协会（SICOT）上海分会委员。2003年毕业后在上海交通大学附属第九人民医院骨科从事临床工作。研究重点为骨与关节损伤、骨折不连和畸形愈合的矫形、人工关节无菌性松动、人工关节感染的防治和骨关节炎的发病机理等。临床擅长关节周围骨折的治疗、骨折不连和骨折畸形愈合的诊断与治疗、骨折的微创治疗等。

论文信息

Chen Zhao, Guantong Sun, Yaxin Li, Keyu Kong, Xiaodong Li, Tianyou Kan, Fei Yang, Lei Wang, Xiaoqing Wang. Forkhead box O3 attenuates osteoarthritis by suppressing ferroptosis through inactivation of NF-κB/MAPK signaling. Journal of Orthopaedic Translation Volume 39, March 2023, Pages 147-162

【福利时刻】科研服务（点击查看）：、、、、、。

【福利时刻】毕业季找工作点击链接，多家企业30W+年薪工作招聘任你选（赶紧点击进入注册，上传简历吧~ ） 。