山西大学中医药现代研究中心：基于肝脏代谢组学的当归“活血解郁”作用机制研究

抑郁症是世界严重的公共健康问题，对人类的健康有极大的影响，给家庭和社会带来了沉重的负担，世界卫生组织预测 2030 年抑郁症将成为全球疾病负担的主要原因 [1] 。目前上市的抗抑郁化学药存在起效慢、不良反应多等局限。因此，在中医理论指导下提出的抑郁症中医临床治疗方法，可以为临床抑郁症的诊治提供切实可行的路径。现代医学研究显示，冠心病、心肌梗死等心血管疾病是抑郁症发病率上升的危险因素。“活血解郁”方法常被应用于抑郁症的临床治疗 [2] ，有云“血脉和利，精神乃居”。然而，现在研究对“活血”与“解郁”两者的相关性仍缺乏直接的证据，其内在机制尚不明确。因此，基于抑郁症临床表现及中医临床实践，提出“活血解郁”治疗策略并进一步探索其潜在机制对认识疾病病机并提高疗效具有重要意义。

当归是伞形科植物当归 Angelica sinensis (Oliv.) Diels 的干燥根，为传统活血要药，相关研究表明其具有促进血液循环、改善血瘀[3] 、调节凝血功能[4] 等药理学作用。现代研究表明，当归具有确切的抗抑郁作用，其机制与改善突触后膜电位、上调脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor ，BDNF ）信号通路等密切相关[5] ，其中有机酸类、苯酞类、多炔类等活性成分可能为当归抗抑郁药效物质基础[6] 。然而，现有研究仅考察了当归对抑郁症的改善作用及机制，尚未关注当归对抑郁症引起的血瘀症状的作用，其抗抑郁作用与其传统活血功效的相关性仍有待进一步研究。

本研究采用慢性不可预见性温和应激（ chronic unpredicted mild stress ，CUMS ）抑郁大鼠模型，通过行为学指标与血流变指标考察当归“活血解郁”的药效，结合相关性分析明确当归解郁与活血功效的相关性；并基于1H-NMR 代谢组学技术对肝脏样本进行分析，筛选潜在生物标志物、富集代谢通路，分析当归对CUMS 大鼠生物标志物的调节作用及“活血解郁”潜在机制，为拓展当归药效理论、理解“郁证”中医古方配伍用药规律提供理论依据，并为抑郁症的临床治疗提供新策略。

1 材料

1.1 动物

SPF 级雄性SD 大鼠72 只，体质量180 ～220 g ， 购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK （京）2016-0011 。 动物于 12 h 明暗交替光照（ 6: 00 时开灯， 18: 00 时关灯）、温度（ 25 ± 2 ）℃、相对湿度（ 50 ± 20 ） % 的环境下饲养，每 2 天定期更换水和垫料，自由摄食饮水，每笼 4 ～ 5 只。动物实验通过山西大学伦理委员会批准（伦理审批号 SXULL2020024 ）。

1.2 药 材

当归（产地为甘肃，批号 1610583111 ）经山西大学中医药现代研究中心秦雪梅教授鉴定为伞形科植物当归A. sinensis (Oliv.) Diels 的干燥根。

1.3 药品与试剂

盐酸文拉法辛胶囊（规格25 mg/ 粒，批号130101 ）购自成都康弘药业集团股份有限公司 ；色谱级甲醇购自美国 Thermo Fisher Scientific 公司；含 EDTA 和肝素钠的真空抽血管购自江苏康捷医疗器械有限公司。

1.4 仪器

大鼠代谢笼（苏州实验动物笼具厂）；大鼠旷场测试箱（长 100 cm 、宽100 cm 、高80 cm ，黑色，25 格，实验室自制）；FC-I 型全自动血流变分析仪（山西亚森实业有限公司）；B600 型离心机（长沙湘智离心机仪器有限公司）；Bruker AVANCE III 600 MHz 型核磁共振波谱仪（瑞士Bruker 公司）；RV10 digital 旋转蒸发仪（德国艾卡集团）；Scientz-1LS 型冷冻干燥机（宁波新芝生物科技股份有限公司） 。

2 方法

2.1 当归提取物的制备

称取一定量的当归饮片，加入 8 倍量的75% 乙醇，回流提取2 次，每次2 h ，合并提取液进行减压浓缩，冷冻干燥备用（出膏率为48.01% ）。采用超高效液相色谱- 质谱联用（UPLC-Triple-TOF/MS ）技术对当归提取物中的化学成分进行分析[7] ，并进一步运用高效液相色谱（high performance liquid chromatography ，HPLC ）法对其主要化学成分阿魏酸及E- 藁本内酯进行含量测定，结果显示当归提取物中阿魏酸及E- 藁本内酯的平均质量分数分别为0.03% 、1.56% 。

2.2 分组与给药

为消除个体差异，根据糖水偏爱实验、旷场实验和体质量测定的数据将大鼠随机分为对照组、模型组、文拉法辛（ 35 mg/kg ）组、当归高剂量组（生药15.0 g /kg 、干浸膏1.00 g /mL ）和当归低剂量组（生药7.5 g /kg 、干浸膏0.72 g /mL ）。大鼠造模同时给药，各给药组ig 相应药物（10 mL/kg ），对照组和模型组ig 等体积蒸馏水，1 次/d ，连续28 d 。

2.3CUMS大鼠模型的制备

参照本课题组前期方法 [8] ，大鼠适应性饲养7 d 后，进行CUMS 造模。除对照组外，其余各组大鼠均孤养，并于每日9: 00 —11: 00 时随机给予应急刺激：禁食（24 h ）、禁水（24 h ）、束缚、超声（60 dB ）、足底电击（36 V 、10 s ）、45 ℃热刺激（10 min ）、夹尾（2 min ）、4 ℃冰水浴（5 min ）、昼夜颠倒（12 h/ 12 h ）。以上刺激方式随机排列，且每种刺激不连续出现。

2.4 行为学 实验

2.4.1 体质量 测定 分别于第0 、7 、14 、21 、28 天分别称定大鼠体质量。

2.4.2 糖水偏爱实验 分别于第 0 、21 、28 天进行糖水偏爱实验。大鼠给予2 瓶1% 蔗糖溶液24 h ，然后将其中1 瓶蔗糖溶液替换为自来水继续训练24 h 。大鼠禁食禁水12 h ，分别给予大鼠1 瓶蔗糖溶液和1 瓶自来水进行糖水偏爱基线测定，计算糖水偏爱率。

糖水偏爱率＝蔗糖溶液消耗量 / 总饮水消耗量

2.4.3 旷场实验 分别于第0 、7 、14 、21 、28 天进行旷场实验，评估大鼠的活动状况和抑郁样行为。将每只大鼠置于自制大鼠开场实验箱的中央格，观察5 min ，记录后4 min 内大鼠的直立次数和穿越格数。

2.5 血流变分析

大鼠禁食 12 h 后，ip 水合氯醛麻醉，采用含肝素钠的真空抽血管于腹主动脉取血2 mL ，采用全自动血流变仪测定全血黏度。

2.6 当归抗抑郁作用和调节血液流变学功能相关性分析

运用 SPSS 软件，对大鼠体质量（X1 ）、糖水偏爱率（X2 ）、直立次数（X3 ）、穿越格数（X4 ）4 个行为学指标进行主成分分析，并计算各组大鼠的情志指数（Y1 ）；对高、中、低切变率下的全血黏度（X5 、X6 、X7 ）进行主成分分析，并计算各组大鼠血液系统综合指标（Y2 ）。

2.7 肝脏代谢组学 分析

2.7.1 肝脏1H-NMR 样本制备 称取各组大鼠肝组织200 mg 于5 mL EP 管中，加入500 μL 预冷的甲醇和500 μL 蒸馏水，匀浆1 min ，超声提取5 min ，4 ℃、13 000 r/min 离心15 min ，取上清液900 μL 于2 mL EP 管中。沉淀采用同样的方法再提取1 次，取上清液900 μL 。合并2 次上清液，取1 mL 上清液置于EP 管中冷冻干燥用于NMR 分析，将干燥物溶解在600 μL 含0.01% 三甲基硅基丙酸钠（sodium trimethylsilylpropionate ，TSP ）的磷酸盐缓冲液（0.2 mol/L Na2HPO4 、0.2 mol/L NaH2PO4 ，pH 7.4 ）中，4 ℃、13 000 r/min 离心10 min ，取上清550 μL 转移至5 mm 的核磁管中用于NMR 检测。

2.7.2 NMR 检测 样品在25 ℃下于600 MHz NMR 仪测定，测定频率为600.13 MHz ，扫描次数为64 ，谱宽12 345.679 Hz ，脉冲时间14 μs ，采样时间2.654 s ，延迟时间1.0 s ，采样间隔40.5 μs ，采用noesygppr1d 序列压制水峰，内标为TSP 。

2.7. 3 NMR 数据处理 所有NMR 图谱分析使用MestReNova 软件进行数据处理与采集。图谱经手动相位和基线校正后，以TSP 化学位移（δ ）0.00 进行定标，以1 ×10−8 的积分对δ 为0.00 ～9.00 的区段进行积分，并剔除δ 为4.50 ～ 5.00 的残余水峰信号。

2.7. 4 多 元统计分析 将获得的数据导入Simca-P 13.0 软件进行分析。采用偏最小二乘- 判别分析（partial least squares-discrimination analysis ，PLS-DA ）和正交偏最小二乘- 判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis ，OPLS-DA ）探究对照组和模型组代谢轮廓的变化，结合S-plot 图中的VIP ＞1 和t 检验（P ＜0.05 ）寻找差异代谢物。采用R2 和Q2 值描述数据模型的可靠性。NMR 寻找到的差异代谢物通过分子结构和化学位移进行鉴定。将鉴定的差异代谢物导入MetaboAnalyst 3.0 进行通路富集分析。

2.7.5 代谢物的回调程度 为了量化各组对潜在生物标志物的回调情况，以效能指数（effectiveness index ，EI ）来描述各组差异代谢物的回调程度[9] 。

C i 表示对照组中潜在生物标志物含量的平均值； M i 表示模型组中潜在生物标志物含量的平均值； X i 表示给药组调节的潜在生物标志物含量的平均值； EI 的值越高，表明给药组对代谢物的回调程度越大

2.8 统计学 分析

数据均以 表示，采用SPSS 19.0 统计学软件进行分析，两组间比较采用独立样本t 检验，多组间比较采用单因素方差分析。

3 结果

3.1 当归对抑郁大鼠行为学的影响

3.2 当归对抑郁大鼠全血黏度的影响

如图 2 所示，与对照组比较，模型组大鼠高、中、低切变率下的全血黏度均显著升高（ P ＜ 0.01 ）；与模型组比较，文拉法辛组大鼠高切变率下的全血黏度显著降低（ P ＜ 0.05 ），当归低剂量组中切变率下的全血黏度显著降低（ P ＜ 0.05 ），当归高剂量组低切变率下的全血黏度显著降低（ P ＜ 0.05 ）。

3.3 当归“解郁”与“活血”功效的相关性分析

3.3.1 主成分分析 运用SPSS 软件，对大鼠体质量（X1 ）、糖水偏爱率（X2 ）、直立次数（X3 ）、穿越格数（X4 ）4 个行为学指标进行主成分分析，第1 主成分的保留特征值为2.643 （＞1 ），累积贡献率达66.082% ，能够代表大鼠行为学指标的综合水平，由此计算情志指数（Y1 ）＝0.512 X1 ＋0.415 X2 ＋0.524 X3 ＋0.540 X4 。采用同样的方法对高、中、低切变率下的全血黏度3 个血流变指标（X5 、X6 、X7 ）进行主成分分析，第1 主成分保留特征值为2.961 （＞1 ），累积贡献率为98.734% ，能够代表大鼠血液流变学的综合水平，由此计算血液系统综合指标（Y2 ）＝0.568 X5 ＋0.578 X6 ＋0.585 X7 。

3.3.2 相关性分析 将计算得到的情志指数与血流变综合指标进行相关性分析，找出与情志指数密切相关的血液流变学指标。如图3 所示，大鼠情志指数与高、中、低切变率下的全血黏度均有一定的相关性（|r| ＞0.35 、P ＜0.05 ）。血流变综合指标与大鼠体质量、糖水偏爱率有一定相关性（|r| ＞0.35 、P ＜0.05 ），而与穿越格数、直立次数无相关性（|r| ＜0.3 ）。大鼠的情志指数与血液系统综合指标的相关系数呈负相关（r ＝−0.393 、P ＜0.05 ）。

3.4 生物标志物的鉴定

采用主成分分析和 PLS-DA 方法对对照组与模型组大鼠肝脏样本获得的数据进行降维处理，如图4-A 、B 所示，对照组与模型组能明显分开，说明抑郁模型复制成功。采用监督的OPLS-DA 模型，结合S-plot 载荷图（VIP ＞1 ）寻找差异代谢物，再经t 检验（P ＜0.05 ）进一步筛选（图4-C 、D ），最终鉴定了与抑郁症相关的19 个差异代谢物（图5 和表1 ）。与对照组比较，模型组肝脏组织中异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、谷氨酸、胆碱、氧化三甲胺、甘油、糖原、延胡索酸含量显著降低（P ＜0.05 、0.01 、0.001 ），乳酸、丙氨酸、乙酸、蛋氨酸、谷氨酰胺、柠檬酸、甘氨酸、葡萄糖、酪氨酸含量均显著升高（P ＜0.05 、0.01 、0.001 ）。

3.5 当归对抑郁大鼠肝组织中差异代谢物的调节作用

如图 6 所示，与模型组比较，给予当归干预后，各差异代谢物均有所回调。其中，当归低、高剂量组异亮氨酸含量、谷氨酰胺显著升高（P ＜0.01 、0.001 ），乳酸、丙氨酸、柠檬酸含量显著降低（P ＜0.05 、0.01 、0.001 ）；当归低剂量组胆碱、糖原含量显著升高（P ＜0.01 ）；当归高剂量组缬氨酸、甘油、甘氨酸含量显著升高（P ＜0.05 、0.01 ），当归对甘氨酸和谷氨酰胺的干预与模型组相似。

3.6 代谢物的回调程度

通过计算 EI 来描述各给药组对差异代谢物的回调程度，结果发现，各给药组在调节CUMS 改变的潜在生物标志物方面存在差异。当归低剂量组、当归高剂量组、文拉法辛组对代谢物的 功效指数之和（EI ）分别为513.38 、733.00 、547.77 （表2 ），表明当归高剂量组能够最大限度将代谢物的异常水平回调至正常水平。

3.7 代谢通路分析

如图 7 所示，采用 NMR 代谢组学技术寻找到与抑郁相关的差异代谢物有 19 个，涉及 8 条代谢途径（ pathway impact ＞ 0.1 ），分别为 D - 谷氨酰胺和 D - 谷氨酸代谢，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸合成，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，乙醛酸和二羧酸代谢，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，甘油脂代谢和酪氨酸代谢。当归对其中 5 条代谢途径都有明显的回调作用，文拉法辛对其中的4 条代谢途径有回调作用。

4 讨论

本研究采用 CUMS 抑郁模型探讨了当归对抑郁大鼠行为学指标与血流变学指标的调节作用以及两者之间的相关性。全血黏度异常增加可引起血液循环及微循环障碍、血液流动性减慢、血管阻滞不 通等 [10] 。本研究结果显示，CUMS 模型大鼠全血黏度显著升高，说明大鼠出现血瘀症状；给药干预后，大鼠全血黏度指标均有不同程度的改善。进一步相关性分析结果表明，当归抗抑郁作用与调节血流变作用具有明显的相关性。中医理论认为，肝能调畅情志[11] ，抑郁症早期主要与肝气瘀滞有关。本研究以代谢组学技术为研究策略，从肝脏的代谢层面探讨了当归“活血解郁”潜在机制，结果表明其机制可能涉及氨基酸代谢、碳水化合物代谢、脂质代谢等代谢途径。

缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸都是人体重要的支链氨基酸，其合成与代谢只存在于植物和部分微生物中。支链氨基酸是一种必需氨基酸，人体无法合成，必须通过外界食物获取 [12] 。支链氨基酸与神经递质5- 羟色胺（5-hydroxytryptamine ，5-HT ）合成密切相关，其与5-HT 的前体物质存在竞争性抑制作用[13-14] ，而以神经递质紊乱为基础的单胺假说是抑郁症经典发病机制。另有大量研究证实，除了传统的危险因素外，外周血中支链氨基酸是冠心病、心力衰竭、动脉粥样硬化、高血压等多种心血管疾病的新危险因素和潜在生物标志物[15] 。结合本研究结果推测，当归可能是通过调节氨基酸代谢发挥“活血解郁”功效。

谷氨酸是最丰富的氨基酸之一，除了在蛋白质结构中的作用外，其在营养、代谢和信号传导中起着关键作用 [16] 。谷氨酸是兴奋性神经递质，其前体谷氨酰胺与谷氨酸的循环对谷氨酸的平衡及神经递质谷氨酸的产生和循环非常重要[17] 。研究发现，前扣带皮层的谷氨酸能功能障碍可能与双相情感障碍的病理生理学有关，且成人双相情感障碍患者和双相抑郁症患者中最为明显[18] 。甘氨酸在模型组大鼠肝脏中含量上升，甘氨酸过量积累与抑郁症的病理生理相关。

脂质代谢紊乱与抑郁症的发生密切相关。相关研究表明，脂质及其代谢物在中枢神经系统中具有广泛的功能，作为蛋白质的配体和底物，脂质改变膜的几何性质并控制蛋白质运输，并提供介导细胞之间通信的信使分子 [19] 。本研究中当归和文拉法辛均使抑郁大鼠的甘油含量回调，其中当归高剂量组接近正常水平。通过调节脂代谢紊乱，可能对抑郁症的治疗和预防具有一定的潜在价值。

本研究以当归为研究对象，使用文拉法辛作为阳性对照药物。药效层面，当归和文拉法辛均能够显著调节 CUMS 大鼠的行为学指标，发挥“解郁”作用，当归能明显改善大鼠低、中切变率下的全血黏度，文拉法辛能改善大鼠高切变率下的全血黏度，二者均能发挥“活血”作用。机制层面，当归能回调部分差异代谢物的含量，说明当归可以改善CUMS 引起的代谢产物变化，调节机体稳态。文拉法辛和当归在差异代谢物的调节作用上有相同趋势，相比之下，中药在治疗抑郁症方面具有独特的优势：从调节代谢物的数量上来看，当归多于文拉法辛，体现了中药多成分多靶点的特性；从调节代谢物的程度上来看，当归的回调作用也强于文拉法辛。总之，当归抗抑郁作用优于化学药，可以通过调节体内代谢物的作用，达到抗抑郁的作用，而且不良反应较小。

现代药理学研究表明，当归能改善 CUMS 诱导的大鼠认知障碍，其作用可能通过改善突触后膜电位、减轻突触和神经元结构的异常改变以及增加BDNF 有关[20] 。当归有确切的抗抑郁作用，但仅限于传统的抗抑郁指标，未结合其传统功效关注抑郁症引起的血瘀症。研究发现，活血通脉中药可降低全血黏度、改善血流情况，改善抑郁动物模型大脑内神经损伤进而缓解抑郁[21] 。本研究中当归可降低CUMS 大鼠的全血黏度，与文献报道一致。综上，当归不仅能改善CUMS 大鼠的抑郁样行为，还能逆转CUMS 大鼠诱导的血液黏度升高，增加血液流动性。其“解郁”与“活血”功效密切相关，机制可能涉及氨基酸代谢、碳水化合物代谢、脂质代谢等代谢途径。本研究结果为全面、深入揭示当归抗抑郁的作用机制提供了新的视角。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略）

来 源：宫文霞，宋亚鹏，王艳丽，周玉枝，秦雪梅．基于肝脏代谢组学的当归“活血解郁”作用机制研究 [J]. 中草药, 2023, 54(19):6314-6322.

【福利时刻】科研服务（点击查看）：、、、、、。

【福利时刻】毕业季找工作点击链接，多家企业30W+年薪工作招聘任你选（赶紧点击进入注册，上传简历吧~ ） 。