比张锋团队提前半个月，姜凯议等人全面解析真核生物中的CRISPR样系统——Fanzor

撰文丨王聪

编辑丨王多鱼

排版丨水成文

众所周知，CRISPR-Cas系统是存在于原核生物（细菌和古菌）中的一类古老的免疫系统，用于抵御防御外源遗传元件（例如噬菌体）入侵。通过对该系统的研究，科学家们开发出了一系列强大的基因编辑工具，例如大名鼎鼎的CRISPR-Cas9。除了原核生物外，许多病毒（噬菌体）中也被发现存在着CRISPR样系统。

而在2023年6月28日，张锋团队在Nature期刊发表论文 【1】 ， ，这项研究提示了我们，RNA引导的DNA切割机制存在于所有生物界。张锋表示，Fanzor系统潜力巨大，有望发展为一种强大的新型基因组编辑技术。

而在张锋团队这篇论文上线前半个月，2023年6月14日，麻省理工学院Omar Abudayyeh和Jonathan Gootenberg实验室（博士生姜凯议为第一作者）在预印本平台 bioRxiv 上线了一篇题为：Programmable RNA-guided DNA endonucleases are widespread in eukaryotes and their viruses 的研究论文。

2023年9月27日，该论文经同行评议后在Science Advances期刊发表 【2】 。

该研究表明，Fanzor作为一种可编程的RNA引导的DNA核酸酶广泛存在于真核生物（Fanzor1）及其相关病毒（Fanzor2）中。Fanzor具有强的核定位信号（NLS），能够进入真核细胞的细胞核，并在fRNA引导下编辑 人类细胞的内源基因，而且没有旁系切割活性，突出了这些广泛存在的真核生物RNA引导的核酸酶的应用潜力。

在寻找新型基因编辑工具领域的竞争异常激烈，论文第一作者姜凯议告诉《生物世界》， 之前大家都在利用Cas系统作为“种子”来寻找真核细胞中的Cas同源物，所以一直没有进展。而在2020年，张锋团队等发现了TnpB后，我们就意识到TnpB大概率是这个关键的搜索“种子”。而在大约十年前，我们这篇论文的合作者Weidong Bao和Eugene Koonin就曾通过生物信息学手段预测过Fanzor的存在，所以我们能在这一领域领先的一部分原因也来自合作者的灵感。当然，我们实验室一直在深入研究RNA引导的核酸酶，这也是速度快的重要原因。

姜凯议

姜凯议，本科毕业于美国莱斯大学，目前是Omar Abudayyeh和Jonathan Gootenberg实验室的博士三年级学生。就在最近，姜凯议作为第一作者在 Nature Biotechnology 和 Science 各发表一篇论文 【3、4】 ，前者开发了一款基于ADAR的可编程RNA传感器；后者解析了可以切割蛋白质的CRISPR系统Cas7-11的结构和作用机制，并将其应用于可编程的RNA传感。

Fanzors是原核TnpB蛋白的真核同源物，已在真核生物和大型病毒的基因组中检测到，但其在真核生物中的活性和功能尚不清楚。 可编程的RNA引导的DNA核酸酶在原核生物中发挥多种作用，这些核酸酶包括Argonaut、CRISPR和OMEGA系统，其中OMEGA系统包括TnpB、IscB、IsrB和IshB核酸酶。

TnpB含有一个RuvC样核酸酶结构域，其与CRISPR-Cas12的核酸酶结构域相关，特别是Cas12f，系统发育分析显示，Cas12是从TnpB进化而来。而含有RuvC的蛋白并不局限于原核生物，TnpB的一组同源物——Fanzor，同样存在于真核生物中。

CRISPR-Cas12、TnpB和Fanzor的对比（来自张锋的Nature论文）

与细菌和古菌中TnpB的多样性类似，Fanzor也已在多种真核生物种类中被发现，包括后生动物、真菌、藻类、变形虫和一些大型双链DNA病毒。目前已确定的Fanzor可分为两类——Fanzor1和Fanzor2，前者与真核转座子有关，主要存在于各种真核生物中；后者在IS607样转座子中发现，存在于双链DNA病毒中。

尽管Fanzor和TnpB有相似之处，但Fanzor尚未在真核生物多样性中进行全面调查，也没有实验表征。

在这项研究中，研究团队全面分析了真核生物和 病毒基因组中RNA引导的核酸酶，发现了在真核生物及其病毒中广泛存在的一类功能性核酸酶。该研究进一步研究了真核生物中Fanzor系统的多样性，通过系统发育分析追踪了它们的进化，并进一步展示了它们的可编程性及RNA引导的DNA内切酶活性，揭示了Fanzor系统作为一种新型基因组编辑工具的实用性。

首先，研究团队发现Fanzor作为来自原核生物的TnpB的同源物，在真核生物（从单细胞真核生物到藻类、真菌、植物和动物）和病毒中广泛存在。进一步分析显示，Fanzor与多种真核生物转座子相关。生化分析显示，Fanzor使用fRNA（相当于CRISPR系统的gRNA）来靶向基因组中的特定位点，作为一类可编程的RNA引导的DNA核酸酶。该研究还发现，Fanzor缺乏对DNA或RNA的 旁系切割活性（Collateral Activity），因此不会在RNA引导下切割目标位点附近的DNA或RNA。

核酸酶需要进入细胞核、接近基因组，才能实现对真核生物的基因组编辑。研究团队使用AlphaFold2预测了ApmFNuc结构 （变形虫的拟菌病毒的IS607转座子编码的一种Fanzor2） ，其N端有64个氨基酸的无序区域，计算预测显示，其N端区域具有一个强、带正电的核定位信号（NLS）。进一步研究显示，ApmFNuc具有很强的细胞核定位，这表明ApmFNuc确实含有功能性NLS序列，这可能是真核生物捕获TnpB后获得的。

姜凯议提到，基于人工智能的蛋白质结构预测工具AlphaFold2对这项研究起到了很大的帮助作用，自己一开始发现核定位信号（NLS） 的存在就是源于AlphaFold2对 Fanzor的预测结构里存在了一个N端不稳定结构。值得一提的是，这篇论文在同行评议时整体上得到了很正向的回复，但有一位审稿人对论文正文中大量运用AlphaFold2来预测蛋白结构而没有去真正解析结构提出了疑问。这也说明业内对AlphaFold2的评价尚有争议。

预测分析显示，在所有Fanzor家族中约60%的开放阅读框中具有易于识别的NLS序列。研究团队从Fanzor1和Fanzor2家族中选择了22个具有预测N端NLS序列的Fanzor，并通过将每个Fanzor的N端100个氨基酸与绿色荧光蛋白sfGFP融合，然后转染到HEK293FT细胞中，结果显示，这22个预测的N端NLS序列中有21个在哺乳动物细胞中具有核定位功能，能够以不同效率进入细胞核。这些结果表明，Fanzor具有进入哺乳动物细胞核从而进一步执行其基因组功能的机制。

接下来，研究团队探索了Fanzor在哺乳动物细胞中的基因编辑潜力。研究团队使用了密码子优化的不同来源的Fanzor1核酸酶——ApmFNuc、DpFNuc、MmFNuc和BaFNuc。结果显示，DpFNuc、MmFNuc和ApmFNuc在工程化fRNA的引导下具有可检测的编辑活性，DpFNuc和MmFNuc在人细胞内的报告质粒上实现了约0.5%-1%的编辑效率。研究团队分析了DpFnuc和MmFNuc对基因组编辑的插入或缺失（indel）模式，发现在目标位点的3'端附近有2-35bp的缺失，这与其他含有可编程RuvC的核酸酶（例如Cas12或TnpB）的indel模式相似。

由于DpFNuc和MmFNuc显示出最高水平的对细胞内质粒的基因编辑，研究团队进一步设计了一组针对7个内源基因组靶点的编辑，编辑效率为0.5%-15%，这进一步验证了Fanzor是RNA引导的核酸酶，而且在哺乳动物细胞中具有基因编辑活性。与对质粒的编辑一样，Fanzor对burden细胞内源基因编辑结果也主要是片段缺失，大小在1-25bp之间。

为了评估Fanzor1核酸酶是否也具有哺乳动物基因组编辑功能，研究团队测试了来自Fanzor1的KnFNuc的编辑效率，结果显示，其在多个内源基因组靶点上的编辑率达2%。这些结果表明， Fanzor1和Fanzor2核酸酶都可以用于人类基因组编辑。

从上述结果来看，Fanzor系统的基因编辑效率还不够高，但姜凯议认为， 从过去的对Cas12和TnpB进行工程化改造的研究来看，蛋白质工程往往可以大幅提高基因编辑工具的效率。所以后续的工作，一方面是寻找更偏向人源的Fanzor，另一方面肯定是利用解析的结构进行蛋白质工程和fRNA工程来提高编辑效率。

总的来说，这项研究证明了Fanzor核酸酶在真核生物及其相关病毒中的广泛存在，而且可以应用于有效的基因组编辑，在人类细胞中具有可检测的基因编辑活性。Fanzor核酸酶结构紧凑，仅约600个氨基酸，可以被更好的递送，并且它们起源于真核生物，这可能有助于减轻其在人类中的免疫原性，但该研究也表明了我们还需要进行额外的工程化来进一步提高Fanzor系统在人类细胞中基因编辑效率。

此外，Fanzor核酸酶在各种真核生物及其相关病毒中的广泛分布表明了真核生物中可能还存在更多目前未知的RNA引导系统，这为未来表征和开发新的生物技术提供了丰富的资源。

值得一提的是，2023年8月10日，CRISPR基因编辑先驱Jennifer Doudna教授团队在预印本 bioRxiv 发布了题为： Eukaryotic RNA-guided endonucleases evolved from a unique clade of bacterial enzymes 的论文 【5】 。

该研究揭示了原核生物的TnpB和真核生物的Fanzor之间的进化关系，并将Fanzor分为两类——Fanzor1和Fanzor2，前者存在于真核生物中，后者存在于真核生物相关病毒中。但这项研究尚未涉及Fanzor的功能和作用机制。

论文链接：

1. https://www.nature.com/articles/s41586-023-06356-2

2. https://www.science.org/doi/full/10.1126/sciadv.adk0171

3. https://www.nature.com/articles/s41587-022-01534-5

4. https://www.science.org/doi/10.1126/science.add7347

5. https://doi.org/10.1101/2023.08.09.552727