Nature Catalysis | 季泉江/申怀宗合作解析Cas12f微型基因编辑器工作机制，并工程改造优化其性能

CRISPR-Cas基因编辑技术由于其简便性和高效性，已被广泛应用在生物医药、农业育种、合成生物学等领域的基础研究与应用中。但当下较为常用的Cas9与Cas12a核酸酶通常具有较大的分子尺寸 （大于1,000个氨基酸） ，而用于递送基因编辑器的病毒载体往往承载容量十分有限，在容纳CRISPR核酸酶与引导RNA的编码序列之余已难以承载其他功能元件，因此严重限制了这类大尺寸基因编辑器的应用。近年来，发掘和鉴定小尺寸Cas核酸酶已成为了基因编辑领域的研究热点。

近年来，一系列紧凑的CRISPR蛋白被挖掘和开发，如Cas12e (~1000个氨基酸)【1】、Cas12f (400-700个氨基酸)【2-4】、Cas12i (~1000个氨基酸)【5】、Cas12j (700-800个氨基酸)【6】、Cas12l (~860个氨基酸)【7】、Casλ (~800 个氨基酸)【8】、TnpB (~400个氨基酸)【9】和IscB (~400个氨基酸)【10】等。但小尺寸核酸酶在哺乳动物细胞中的编辑活性普遍较低、甚至完全没有活性，难以直接应用于基因治疗管线开发。而通过结构指导的理性设计等手段的工程改造后，其中一部分小尺寸核酸酶体现了可观的基因编辑活性【11-16】。2021年上海科技大学季泉江团队在Nature Chemical Biology杂志发表论文，首次证明了微型基因组编辑器AsCas12f1 （仅包含422个氨基酸，仅有Cas9分子尺寸的三分之一） 的编辑活性【4】。未经任何工程改造的AsCas12f1核酸酶即可在细菌和哺乳动物细胞中发挥基因编辑器的功能，但编辑效率相对低于Cas9和Cas12a。

2023年7月31日，上海科技大学季泉江教授团队与西湖大学申怀宗教授团队合作在Nature Catalysis杂志发表题为Structure and engineering of miniature Acidibacillus sulfuroxidans Cas12f1的研究论文。该研究通过冷冻电镜技术解析了微型基因编辑系统CRISPR-AsCas12f1的三元复合体的结构，揭示了其精细结构特征与工作机制，并基于结构引导的蛋白质理性设计，系统性提升了它在哺乳动物细胞中的基因编辑活性。

研究人员利用冷冻电镜技术解析了AsCas12f1-sgRNA-dsDNA三元复合体结构 （分辨率为2.7 Å） ，揭示了小尺寸核酸酶AsCas12f1可以形成不对称同源二聚体结构，从而结合一分子sgRNA，并靶向结合于靶DNA序列上（图1）。这样独特的分子结构使它能够通过更小的分子尺寸来行使和大型核酸酶相似的基因编辑功能。不仅如此，AsCas12f1核酸酶的sgRNA亦十分独特，包含一个多茎环组成的同轴RNA螺旋结构，它对整体引导RNA的稳定性以及核酸酶活性至关重要，通过与同源核酸酶Un1Cas12f1的复合体结构比较，发现该同轴RNA螺旋结构在演化中可被蛋白中额外增加的锌指结构域所替代。这一发现为进一步理解Cas核酸酶的演化过程提供了新的证据。除此之外，论文亦揭示了AsCas12f1自发形成同源二聚体的具体分子机制、识别原始间隔邻近基序 （Protospacer-adjacent motif, PAM） 的关键氨基酸残基位点、以及同源二聚体中各个单体核酸酶分子对引导RNA结合、底物识别与切割的具体分工。这些发现为进一步工程改造该系统，提升其在哺乳动物细胞的基因编辑活性提供了理论基础。

图1：AsCas12f1复合体结构以及与Un1Cas12f1复合体结构的比较。

为进一步提高AsCas12f1基因编辑系统的活性，研究人员对AsCas12f1的RNA进行了工程化改造，分别对sgRNA的R:AR区域进行了不同长度的截短、或在sgRNA的3’末端添加了额外的polyU结构。体外切割和哺乳动物细胞编辑测试表明，截短体sgRNA_T1能够显著提高基因编辑性能

与此同时，研究人员分别在AsCas12f1核酸酶的REC、WED和RuvC结构域上设计了92种核酸酶氨基酸残基替换突变体，以增强了核酸酶与底物DNA或引导RNA之间的相互作用或整体结构灵活性。最终获得的组合突变体AsCas12f1-v5.1包含5种氨基酸残基替换突变 （N70Q、K103R、A104R、S118A和D364R） ，在哺乳动物细胞中的基因编辑活性得到了显著提升。与原始的野生型AsCas12f1相比，活性提升了1.5~13.5倍。

为更全面的评测工程改造后的CRISPR-AsCas12f1系统的基因编辑性能，研究人员选择了14个同时具备5’-TTTR和3’-NGG PAM序列的基因组位点，系统性比较了AsCas12f1-v5.1、Un1Cas12f1-v3.1、enAsCas12a和SpCas9 的基因编辑活性。经无偏倚、无富集的平行比较，结果表明AsCas12f1-v5.1与enAsCas12a和SpCas9的基因编辑活性相当，且在多数位点上活性高于Un1Cas12f1-v3.1。随后，研究人员通过全基因组范围内评估脱靶的金标准方法GUIDE-seq，测试了4中核酸酶在6个基因组位点上的脱靶现象，其中AsCas12f1-v5.1的基因编辑安全性显著优于常用的大型核酸酶。

工程改造后的CRISPR-AsCas12f1系统具有超迷你的分子尺寸 （422个氨基酸） ，可满足AAV等病毒递送系统对分子尺寸的严苛要求，且性能优异。本研究为工程化改造CRISPR基因编辑器提供了新的理论参考，为基因治疗的临床应用提供了新利器。

值得一提的是季泉江课题组近期开了另外一类新颖Cas12n微型基因编辑器，具有与AsCas12f1互补的AAN PAM识别特性和高效的编辑活性【17】(详见BioArt报道：)。

上海科技大学季泉江课题组助理研究员吴兆韡博士、博士研究生潘登和西湖大学生命学院刘栋梁博士为共同第一作者。上海科技大学季泉江教授和西湖大学申怀宗教授为共同通讯作者。上海科技大学为第一完成单位。

论文链接：

https://www.nature.com/articles/s41929-023-00995-4‬‬

参考文献

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