《ESN》博洛尼亚大学：用于检测水中微米和纳米塑料的荧光透明质酸纳米凝胶

第一作者：MatteoCingolani

通讯作者：DamianoGenovese

通讯单位：博洛尼亚大学

研究介绍

由于人类活动，塑料对环境的污染呈指数级增长。虽然可以通过各种方法检测较大的微塑料，但检索微米大小的碎片和纳米塑料仍然具有挑战性。然而，这些较小尺寸的塑料引起了相当大的毒理学担忧。在这里，我们表明，用罗丹明B（HA-RB）功能化的发射性差的透明质酸以高亲和力粘附到各种微塑料表面，变得明亮发光。可以成功检测尺寸小至共焦显微镜衍射极限（约250 nm）的微米和纳米塑料(MNPs)。FLIM图像显示，染料部分的荧光寿命根据塑料而变化，使得根据寿命区分MNPs的性质成为可能。与之前的报告相比，HA-RB消除了由染料聚集体形成引起的假阳性结果，从而产生更高的信噪比，从而可以明确检测纳米级片段。

合成部分

将HA（200–600 kDa，30 mg）分散在DMSO（8 mL）中，并在搅拌下添加异硫氰酸罗丹明B（RITC，4.4 mg）；使反应在室温下进行24小时。然后用水（8 mL）稀释产物，并通过透析（在室温下至少3天，再生纤维素，截止值12 kDa）消除未反应的RITC，最终获得功能化HA-RB在水中的分散体每约1个RB部分60个HA单体（HA单体单元的掺杂度为1.7%，即每个HA聚合物链约18个RB染料）。

荧光成像样品制备

称重MNPs样品并在机械搅拌下与1 mL含有170 nM HARB的水溶液一起孵育。之后，将30 μL体积的MNPs分散体与一滴100μL透明质酸水凝胶(16 mg ml-1）直接在载玻片上混合。该溶液体积确保水凝胶滴在实验过程中保持粘稠，以均匀分散样品并延迟蒸发。相同的程序已用于与尼罗红一起孵育微塑料。在第二组实验中，我们添加了纯化程序。将两组微塑料样品在玻璃瓶中机械搅拌下孵育30分钟，其中一组加入1 mL 170 nM HA-RB水溶液，另一组加入5.6 nM HA-RB。孵育后，向每个小瓶中加入2 mL水，然后以5000 rpm离心10分钟。该过程分离了MNPs片段，而未吸附的HA-RB纳米凝胶则保留在上清液中，并用巴斯德吸管小心地除去2 mL。然后向每个样品中添加2mL新水并再次离心。重复该洗涤过程3次。最后，我们将离心的MNPs与HA水凝胶混合进行共焦和FLIM成像。

光物理表征

共聚焦图像在浸油的Nikon A1R显微镜、高数值孔径物镜( NA = 1.45 ,放大倍数100 ×)、激发光为561 nm、发射滤光片为595/50 nm的GaAsP PMT上进行配准。采集参数设置为1 A.U.，8 ×信号平均，共振扫描模式，激光功率= 1.64 %，PMT GaAsP HV = 70。对于所有分析的样品，该设置保持不变。为了获得较大的MNPs统计集合，我们获得了10 × 10的拼接图像，最终视场为1.2 × 1.2 mm2，单个像素大小为124 nm。

FLIM图像由时间相关单光子计数( TCSPC )系统( PicoQuant GmbH柏林公司)采集，使用重复频率为10 MHz的405 nm脉冲激发激光器、560 nm长通发射滤波器、混合PMA探测器和PicoQuant PicoHarp 300相关板。用SymPhoTime 64，PicoQuant GmbH分析FLIM图像。

图像分析

使用基于ImageJ命令的粒子跟踪宏对不同样品的共焦图像进行了分析。编写宏来处理具有可比条件的大图像，并获取区域内所有碎片的相关信息。它处理图像以查找尺寸大于像素尺寸（124 nm）且像素强度高于预设阈值的颗粒。输出包括面积、最小、最大和平均像素强度以及识别区域的积分。

结果与讨论

微米和纳米塑料的 HA–RB 测试

正如在 561 nm 激发下通过共焦荧光显微镜容易观察到的那样，与 HA-RB 混合后，MNPs在 590 ± 30 nm 范围内变得明亮发光。共焦图像（图 1）显示，当碎片非常大（少数碎片直径达到 100 微米）和碎片直径约为 1 微米时，MNPs均被有效标记并与背景清晰地区分。油浸共焦切片，高数值孔径物镜（NA = 1.45，放大倍数 100×）可以确认 HA-RB 标记是表面过程，并且 MNPs中没有发生 HA-RB 渗透，如暗光证明MNPs的内部部分，进而显示出明亮的荧光表面（图 1）。

我们使用基于 ImageJ 的粒子跟踪例程分析了共焦图像，该例程根据远高于背景噪声的强度阈值选择粒子（例如，背景信号的阈值 = 约 500 计数 = 64 ± 12 计数）。绘制积分像素强度与 MNPs片段大小（等效直径）的关系图表明，正如预期的那样，随着大小的增加，总体荧光信号在片段中逐渐增强（图 2）。绘图的亚微米部分显示，大量纳米塑料被 HA-RB 明亮地标记，并且它们以背景噪声的∼10 至>200 倍的整体强度从背景中脱颖而出。在双对数图中，强度显示出清晰的线性趋势，与表面吸附过程的预期斜率非常吻合，接近2。所有塑料样品的斜率均略大于2，这表明微塑料具有具有较高分形维数的粗糙表面。20通过拟合，我们可以计算出与单个像素（侧 124 nm），可以与背景进行方便的比较，表明用 HA-RB 染色的 MNPs 显示 124 nm 尺寸背景平均强度的 3.5（PMMA-iso）和 7.4 倍（PMMA）之间（表1）。我们将这些结果与使用可溶于水的分子染料罗丹明 B (RB) 进行比较。RB 对 MNPs表面表现出良好的亲和力，微塑料碎片具有高发光性。然而，RB在水中也具有高发射性，因此溶液中的高信号阻碍了检测小纳米塑料碎片的可能性。

使用 HA-RB 对 MNP 进行荧光寿命成像

还研究了RB部分与MNPs相互作用时激发态寿命的变化。正如之前所发现的，HA-RB在水中的寿命很短并且是多指数的，对应于广泛的自猝灭状态。有趣的是，平均寿命在与MNPs相互作用时显示出相关的变化，表明HA-RB纳米凝胶的构象发生变化，其中一部分自猝灭的RB部分从类单体状态变为发射性。

特别是，在低浓度的HA-RB下，HA-RB在MNPs表面上的荧光衰减显得更长，并且在某些情况下，也更类似于水中HA-RB纳米凝胶的单指数衰减(图1）。这可以通过疏水性诱导的不猝灭机制来解释：由于HA-RB在MNPs表面吸附时的构象变化，导致RB二聚体和聚集体的断裂（负责初始自猝灭和HA-RB聚集为纳米凝胶），从而导致平均寿命局部增加，寿命分布变窄，从而提高荧光量子产率。然而，构象变化似乎对表面类型非常敏感，因此不同类型的MNPs的寿命都有不同程度的增加。因此，值得注意的是，在这些条件下，MNPs的化学性质可以通过FLIM分析变得明显，从而可以直接区分PS和PMMA微塑料，如图3所示，即使在混合在一起。

寿命对特定塑料表面的依赖性可以通过两种不同相互作用的相互作用来解释：第一个是疏水相互作用，它会导致寿命的增加，并且表征了HA-RB与纯疏水性塑料表面的结合，例如如聚四氟乙烯和聚氯乙烯。在与MNPs表面的亲和力中发挥作用的第二种相互作用是由于HA-RB的透明质酸官能团形成的氢键，这可能与PMMA和PET MNPs的疏水性较低的表面的结合更相关。与其他塑料聚合物相比，PS显示出一种特殊的行为，其中与苯乙烯单元的电子相互作用可能是HA-RB的短且近似单指数寿命的基础。

然而，在较高的HA-RB浓度下，HA-RB层在MNPs表面上的积累再次改变了RB部分的光物理学。MNPs表面的局部强度增加，但发射衰减逐渐变短且呈多指数衰减。MNPs表面上额外的HARB确实增加了RB染料的局部密度，因此增强了RB部分之间自猝灭相互作用的可能性，导致观察到更短的多指数寿命（图4）。由于这些原因，应使用低浓度的HA-RB来区分不同种类的塑料。

HA-RB即使在极低的( 1-10 μM浓度范围内,与用于测试尼罗红的典型浓度进行比较的5 nM聚合物链和100 nM罗丹明B染料 )浓度下也能很容易地对微纳米塑料进行染色，这可以解释为HA-RB纳米探针对许多塑料表面的高亲和力和高PLQY的共同作用，因为当探针粘附在这些表面时，RB部分的发光可以有效地开关。

结论

总之，我们在这里报道了一种荧光材料，即罗丹明B功能化的透明质酸( HA-RB )，在水中具有很弱的荧光强度，但容易吸附在各种MNPs的表面，伴随着亮度的增强，使它们具有荧光。荧光染色的MNPs清晰可见，尺寸与共聚焦显微镜的分辨率一样小，背景外有大约250 nm的纳米塑料碎片。由于疏水性诱导的非猝灭机制以及与MNPs的高亲和力相互作用，RB部分的荧光量子产率的恢复可以实现这种高灵敏度。这些性质允许即使在探针浓度很低( 5 nM )的情况下也能检测MNPs。此外，寿命参数揭示了HA-RB在不同微塑料表面的疏水性诱导的非淬灭程度不同，使得基于荧光寿命识别MNPs的类型成为可能。

这些结果代表了在控制条件下的可行性研究，其对环境样品中真实MNPs碎片的适用性仍然是一个挑战。然而，已报道的荧光透明质酸的内在多功能性代表了一个宝贵的优势：事实上，通过改变HA和荧光部分的质量、衍生化甚至化学，可以精细地调节荧光透明质酸纳米凝胶的各种性能。这种多功能性潜在地非常有利于设计不同应用的定制探针，其中灵敏度需要适当平衡对不同种类干扰物和不同实验条件的选择性。