实验干货|脲酶、磷酸酶、蔗糖酶超详解测定方法！

脲酶测定（苯酚钠-次氯酸钠比色法）

原理：脲酶存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶作用是极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和二氧化碳、水。土壤脲酶活性，与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。脲酶是对尿素转化起关键作用的酶，它的酶促反应产物是可供植物利用的氮源，它的活性可以用来表示土壤供氮能力。

土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚—次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。

试剂配制：

1、pH6.7柠檬酸盐缓冲液：

取368 g柠檬酸溶于600 mL蒸馏水中，另取295 g氢氧化钾溶于水，再将二种溶液合并，用1 mol/L NaOH（4g氢氧化钠溶于100ml水）将pH调至6.7，用水定容至2L。

2、10%尿素：

称取100g尿素，用水溶至1000mL；

3、苯酚钠溶液（1.35mol/L）：

A液：62.5g苯酚溶于少量乙醇，加2mL甲醇和18.5mL丙酮，用乙醇稀释至100 mL；

B液：27g NaOH溶于100ml水。

A、B溶液保存在冰箱中。使用前将2溶液各100毫升混合，用蒸馏水稀释至500ml。

4、次氯酸纳溶液：

取活性氯≥5.5%的次氯酸钠溶液81.81ml定容为500 ml 溶液

5、甲苯：(直接购买)

操作步骤:

1、取5g鲜土或10g干土，置于50mL三角瓶中，加1mL甲苯。15min后加10mL 10%尿素液和20mL pH6.7柠檬酸盐缓冲液，摇匀后在37℃恒温箱中培养24 h。

2、过滤后取3mL滤液于50mL容量瓶，然后加水至20mL，再加4mL苯酚钠溶液，仔细混合，加入3mL次氯酸钠溶液，充分摇荡，放置20min，用水稀释至刻度，一小时之内将着色液在紫外分光光度计上于578nm处进行比色测定。

标准曲线绘制：

氮的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到0.1mg/ml的氮标准液，配标曲时稀释10倍。

吸取氮标准液50mL，定容至500mL，即稀释10倍，吸取0，1，3，6，9，12，15，18mL移至50 mL容量瓶，加水至20mL，再加入4mL苯酚钠溶液，仔细混合，加入3mL次氯酸钠溶液，充分摇荡，放置20min，用水稀释至刻度。一小时之内将着色液在紫外分光光度计上于578nm处进行比色测定，以标准溶液浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制曲线图。

结果计算:

脲酶活性以24小时后1g土壤中NH3－N的毫克数表示土壤脲酶活性（Ure）。

NH3－N=（a样品－a无土－a无基质）×V×n／m

式中：a样品——为样品吸光值由标准曲线求得的NH3－N浓度（mg/mL）；

a无土——为无土对照吸光值由标准曲线求得的NH3－N毫克数；

a无基质——为无基质对照吸光值由标准曲线求得的NH3－N毫克数；

V——为显色液体积（50mL）；

n——为分取倍数，浸出液体积／吸取滤液体积，此处为10；

m——表示烘干土重

磷酸酶（磷酸苯二钠比色法）

原理：测定磷酸酶主要根据酶促生成的有机基团量或无机磷量计算磷酸酶活性。前一种通常称为有有机基团含量法，是目前较为常用的测定磷酸酶的方法，后一种称为无机磷含量法。研究证明：磷酸酶有三种最适PH值：4~5、6~7、8~10。因此，测定酸性、中性和碱性土壤的磷酸酶，要提供相应的PH缓冲液才能测出该土壤的磷酸酶最大活性。测定磷酸酶常用的PH缓冲体系有乙酸盐缓冲液（PH5.0~5.4）、柠檬酸盐缓冲液（PH7.0）、三羟甲基氨基甲烷缓冲液（PH7.0~8.5）、和硼酸缓冲液（PH9~10）。

试验配制：

1、Ph5醋酸缓冲液:

A液：0.2mol/L 醋酸溶液（11.5 mL醋酸，稀释定容至1000 mL）

B液：0.2mol/L醋酸钠溶液（32.8g C2H3O2Na 或54.4g C2H3O2Na·3H2O 定容至2000mL），

592 mL A+1408mL B混合即得2000ml缓冲液

2、0.5%磷酸苯二钠:

10g磷酸苯二钠溶于2000ml缓冲液

3、 0.3%硫酸铝:

11.692g 18水合硫酸铝溶于2L水

4、氯代二溴对苯醌亚胺试剂：取0.30g 2，6-二溴对苯醌亚胺，用24 mL 96%乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用。

5、甲苯：（直接购买）

6、pH9.4硼酸盐缓冲液：

A：0.05M硼砂溶液：19.07g硼砂（Na2B4O7·10H2O）溶于1000 mL蒸馏水中

B：0.2 M 硼酸溶液：12.37g硼酸（H3BO3）溶于1000 mL蒸馏水中

800mL A+200mLB混合即得1000ml硼酸缓冲液

操作步骤：

1、称2g鲜土（5g干土）于200ml三角瓶中，加2.5ml 甲苯，轻摇15min后，加入20ml 0.5%磷酸苯二钠（酸性、中性磷酸酶用PH5醋酸盐缓冲液配制，碱性用PH9.4硼酸盐缓冲液配制），仔细摇匀后放入恒温箱，在37℃下培养24h。

2、到时取出，于培养液中加40ml 0.3%硫酸铝溶液并过滤。

3、吸取3ml滤液于50ml容量瓶中，然后加入5ml pH9.4硼酸盐缓冲液，充分摇匀后，加入5滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，充分摇匀至显色明显后定容，30min后比色测定。（用硼酸缓冲液显色时，呈现蓝色，用660nm比色）

标准曲线配制：

酚原液——取1g重蒸酚(苯酚)溶于蒸馏水中，稀释至1L，贮于棕色瓶中。

酚工作液——取5ml酚原液稀释至500ml（每毫升含0.01mg酚）。

分别取1、5、9、13、17、21、25ml 酚工作液于50ml容量瓶中，每瓶加入5ml pH9.4硼酸盐缓冲液 缓冲液，充分摇匀后，再加入5滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，充分摇匀至显色明显后定容，30min后在分光光度计上于660nm 处比色测定。以吸光度为横坐标，浓度为纵坐标（mg）绘成标准曲线。

结果计算：

磷酸酶活性，以24h后1g土壤中释出的酚的毫克数表示。

酚（mg）=（a样品- a无基质- a无土）*8

a样品——吸光值由标准曲线求得的酚毫克数；

a无土——无土对照吸光值由标准曲线求得的酚毫克数；

a无基质——无基质对照吸光值由标准曲线求得的酚毫克数；

8——换算成1g土的系数。

蔗糖酶测定（3，5-二硝基水杨酸比色法、滴定法）

原理：蔗糖酶与土壤许多因子有相关性，如与土壤有机质、氮、磷含量，微生物数量及土壤呼吸强度有关，一般情况下，土壤肥力越高，蔗糖酶活性越高。蔗糖酶酶解所生成的还原糖与 3，5-二硝基水杨酸反应而生成橙色的3-氨基-5-硝基水杨酸。颜色深度与还原糖量相关，因而可用测定还原糖量来表示蔗糖酶的活性。

试剂配制：

1、8%蔗糖溶液:

取86.9565 g蔗糖溶于1L蒸馏水。

2、pH值为5.5的磷酸缓冲液:

9.078 g KH2PO4溶于1L蒸馏水中取950mL，1.1867 g Na2HPO4·2H2O溶于100 mL蒸馏水中取50mL，混合得1000ml磷酸缓冲液。

3、3，5-二硝基水杨酸溶液（DNS试剂）:

称取2.5 g二硝基水杨酸，溶于100mL 2 mol/L氢氧化钠（8g氢氧化钠配制成100m溶液）和250mL水中，缓慢加热并搅拌至完全溶解(需要较长时间)，再加入150 g酒石酸钾钠，搅拌至溶解，用水稀释至500mL。

（避光保存，不超过一周，最好用无CO2水配制该溶液）

4、甲苯：(直接购买)

操作步骤：

1、称2 g 鲜土（偏少一点）于50mL三角瓶中，加入5滴甲苯，15min后注入15mL 8%蔗糖溶液和5mL pH5.5磷酸缓冲液，摇匀混合物后，放入恒温箱，在37℃下培养24 h。

2、到时取出，迅速过滤。从中吸取滤液0.5mL，注入50mL 容量瓶中，加3mL 3，5-二硝基水杨酸，并在沸腾的水浴锅中加热5min，随即将容量瓶移至自来水流下冷却3min。溶液因生成3—氨基-5-硝基水杨酸而呈橙红色，最后用蒸馏水稀释至50mL，并在分光光度计上于波长508nm处比色。

标曲的配置：

标准葡萄糖溶液：将葡萄糖先在50-58℃条件下干燥至恒重，然后取2.5g溶于500mL蒸馏水中，即成葡萄糖标准溶液（5mg/mL）（冰箱中4℃保存期约一星期，若该溶液发生混浊和出现絮状物现象，则应弃之，重新配制）。再取标液25ml稀释10倍制成250ml葡萄糖工作液（0.5mg/mL）。

绘制标准曲线：取0、2、4、6、8、10、10、14mL葡萄糖工作液，分别注入50mL容量瓶中，加3mL 3，5-二硝基水杨酸，混匀，并在沸腾的水浴锅中准确反映5min，随即将容量瓶移至自来水流下冷却3min至室温。溶液因生成3—氨基-5-硝基水杨酸而呈橙黄色，最后用蒸馏水稀释至50mL，以空白管调零在波长508nm处比色，以吸光度值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。

结果计算：

以24h后1g土壤中葡萄糖的质量（mg）表示蔗糖酶活性（Suc）：

Suc=（a样品－a无土－a无基质）·V· n /m

a样品、a无土、a无机质——分别表示其由标准曲线求的葡萄糖浓度（mg/mL）；

V——为显色体积（50mL）；

n——为分取倍数，此为20；

m——为土重（g）。

滴定法

1.试剂配制：

(1)20％蔗糖：（20g蔗糖＋80ml水或12.5g蔗糖＋50ml水）

(2)甲苯(分析纯)

(3)PH5.5醋酸盐－磷酸盐缓冲液

0.5ml磷酸氢二钠·12 H2O(1/15M) + 9.5ml 磷酸二氢钾（1/15M）

磷酸氢二钠·12H2O(1/15M) ：23.88g Na2HPO4，，加H2O溶解，定容至100ml。

磷酸二氢钾（1/15M）：9.072g KH2PO4，加H2O溶解，定容至1000ml。

(4)33%KI溶液（4.925g+10ml水）现配，冰箱遮光

(5) H2SO4（1：3）（体积比）：15ml 98% H2SO4 + 45ml蒸馏水

(6)淀粉指示剂

取0.5g淀粉溶于少许水中，加10ml煮沸的2.5%NaCl液煮沸1min。 （2.5%NaCl：2.5g NaCl加97.5ml蒸馏水。）

(7)0.1NNaS2O3 滴定液

取25克-----溶解于刚煮沸而冷却的蒸馏水中，加入少量的碳酸钠，稀释至1升。

(8)菲林溶液

取3.464克CuSO4·5H2O溶于蒸馏水，并稀释至50ml（a），取17.3g酒石酸钾钠和5gNaOH溶于蒸馏水，并稀释至50ml（b），使用前将（a）（b）按1：1混合。

2.操作步骤

取2.5g土置于100ml三角瓶→用0.375ml甲苯处理15min。加2.5ml 20％蔗糖和2.5ml pH5.5醋酸铅－磷酸盐缓冲液摇匀后放在37度恒温箱中培养24h。

培养结束后，加12.5ml蒸馏水。

摇荡后过滤，取5ml的滤液移入100ml三角瓶中，加2.5ml的菲林溶液，在沸水浴上放置10min，冷却至室温后，再加0.75ml 33%KI溶液和1ml H2SO4（1：3）。加入淀粉指示剂2滴，然后用0.1N NaS2O3 滴定。

颜色：棕色→棕蓝色→乳白色（滴定结束）

注意：减量滴定，一般取5ml即可，滴定需Na S2O3 溶液（大量）

空白对照：30.15ml（取5ml时）

3． 结果计算：

蔗糖酶活性（M），用对照与试验的0.1NNaS2O3滴定量毫升数之差表示。试验应设以水20毫升代替基质。

M=（A－B）×T×17.875/5/2.5 式中：

A：对照所消耗的0.1NNaS2O3 毫升数

B：滤液所消耗的0.1NNaS2O3毫升数

T：NaS2O3 滴定度的校正值

×17.875/5/2.5：换算成1g 土消耗的0.1NNaS2O3 量

氨基糖、木质素酚、磷脂脂肪酸、微生物量碳氮磷、同位素、微塑料、植硅体等指标均可测定。

检测项目：土壤/植物/水体/肥料/饲料/农药残留/稻米品质/果实品质

请S O 华 标 测