南京工业大学团队重新编程解脂耶氏酵母的脂肪酸代谢

Omega-6 多不饱和脂肪酸（ω6-PUFAs），如 γ-亚麻酸（GLA）、二高-γ-亚麻酸（DGLA）和花生四烯酸（ARA），是人体健康不可或缺的营养素。

ω6-PUFAs 可以衍生为类二十烷酸，如前列腺素、血栓素、白三烯和脂氧素，在体内多种稳态过程中发挥着关键作用，因此 ，ω6-PUFAs 对预防和治疗炎症性疾病、心血管疾病、癌症和糖尿病有多种健康益处和药用效果，通常被添加到婴儿配方奶粉、营养补充剂、化妆品和药品中。

目前，GLA 通常从植物油或真菌Mucor circinelloides中提取生产；DGLA 可以通过工程真菌或酵母发酵生产；ARA 主要通过真菌Mortierella alpina和微藻Myrmecia incisa发酵生产。

（来源：Bioresource Technology）

在近期发表于Bioresource Technology期刊的一项研究中，南京工业大学纪晓俊团队利用解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）的脂肪生成途径为生产定制 ω6-PUFA 创造了一个潜在平台。其定制菌株合成的 GLA、DGLA 和 ARA 占 TFAs 的比例分别为 22.58%、46.65% 和 11.30%，相应的滴度在摇瓶发酵中分别达到 386.59、832.00 和 191.76 mg/L。相关研究论文题为“Reprogramming the fatty acid metabolism of Yarrowia lipolytica to produce the customized omega-6 polyunsaturated fatty acids”。

两条需氧途径在解脂耶氏酵母中异源表达

总的来说，这项研究将Mortierella alpina（高山被孢霉，丝状真菌）的 Δ6 途径或Isochrysis galbana（球等鞭金藻） 的 Δ8 途径在Yarrowia lipolytica中异源表达，旨在探索定制生产 ω6-PUFA 的最佳生物合成途径。也就是将这两种生产路径在解脂耶氏酵母中表达，确定生产 GLA 、DGLA、ARA 的最佳方法。

Yarrowia lipolytica是一种多功能酵母，它的天然脂肪酸谱包括油酸（OA）和亚油酸（LA），这两种丰富的不饱和脂肪酸可以作为合成 ω6-PUFAs 的前体。此前已有在解脂耶氏酵母中合成生产 GLA、DGLA 和 ARA 的案例。

ω6-PUFAs 的生物合成涉及两条不同的从头开始的途径，即需氧去饱和/延长酶途径和厌氧聚酮合酶类（PKS-like）途径，这两条途径已经在许多生物体中被发现并被广泛表征。

其中，根据去饱和酶和延长酶的不同特异性，需氧途径可进一步分为 Δ6 和 Δ8 亚途径。

▲图丨自然界中 ω6-PUFAs 的两种需氧生物合成途径（来源：Bioresource Technology）

在 Δ6 途径中，Δ6 去饱和酶首先将 LA 转化为 GLA，之后 Δ6 延长酶将 GLA 转化为 DGLA，最后 Δ5 去饱和酶将 DGLA 转化为 ARA。

在 Δ8 途径中，由 Δ9 延长酶对 LA 进行初步转化，形成二十碳二烯酸（EDA），随后由 Δ8 去饱和酶将 EDA 转化为 DGLA，最后 Δ5 去饱和酶催化从 DGLA 生成 ARA。

可以看到，Δ6 和 Δ8 途径都使用 LA 作为前体，差异在于这两种途径中去饱和和延长反应所需的底物形式不同。延长酶主要使用酰基-CoA作为底物，而去饱和酶优先使用磷脂酰胆碱（PC）Sn-2 位点的酰基作为底物，因此在 PUFA 合成过程中，酰基底物需要通过酰基编辑途径在酰基-CoA 和 PC 池之间进行交换。

由此产生的底物二分法是需氧途径中 PUFAs 合成的代谢瓶颈之一。

▲图丨由去饱和酶和伸长酶的不同首选底物形式引起的底物二分法（来源：Bioresource Technology）

Δ8 途径更适合在解脂耶氏酵母中合成 ARA

研究人员使用的底盘菌株系该课题组此前构建，具有较高同源重组效率和较高的 OA 产量。

工作内容一：在解脂耶氏酵母中组装Mortierella alpina的 Δ6 途径以合成 ARA。

结果表明，由两个底盘衍生的工程菌株 WJ-2 和 WJ-3 产生的 ARA 占总脂肪酸含量的 0.24% 和 0.25%，摇瓶发酵中相应的滴度分别达到 1.19 和 1.93 mg/L。另外，GLA 分别占总脂肪酸含量的 3.73% 和 5.91%，而 DGL A分别占 0.48% 和 0.57%。

意外的是，同时还检测到三种不寻常的脂肪酸副产物。副产品之一在总脂肪酸中的占比明显高于 ARA， 这使得Δ6 途径不适合在解脂耶氏酵母中合成 ARA。

工作内容二：在解脂耶氏酵母中组装Isochrysis galbana的 Δ8 途径以合成 ARA。

结果显示，由两个底盘衍生的工程菌株 WJ-4 和 WJ-5 产生的 ARA 分别占总脂肪酸含量的 0.35% 和 0.49%，摇瓶发酵中相应的滴度分别达到 1.60 和 3.66 mg/L。另外，EDA 分别占总脂肪酸含量的 2.22% 和 3.05%，而 DGLA 占总脂肪酸含量的 4.24% 和 16.24%。

与 Δ6 途径不同的是，Δ8 途径没有合成上面提到的三种副产物脂肪酸；但是出现了一种新的副产物，不过这种副产物可以进一步转化为 ARA。

这一结果表明，在 Δ8 途径中不会积累额外的副产品，这表明它更适合在解脂耶氏酵母中合成 ARA。

优化策略调整各脂肪酸含量

在筛选出合成 ω6-PUFAs 的最佳途径后，通过增加合成 ω6-PUFAs 的前体 LA和用于脂肪酸去饱和的载体 PC的供应，有效提高了 ω6-PUFAs 在 TFAs 中的比例。

一方面，增加 LA 的供应。研究人员通过增加相关基因的拷贝来促进 OA 向 LA 的转化，经此操作，LA 的比例增加，ARA 的比例也随之上升；

另一方面，增加 PC 的供应。PC 的供应增加为去饱和酶提供了更多 PC 的 sn-2 位点的酰基底物，这促进了脂肪酸的去饱和，最终导致 PUFAs 的比例增加。

研究人员还增强 LA 向 EDA 的转化，以及 DGLA 向 ARA 的转化，来平衡代谢流和改善 ARA 的合成。

随后，通过破坏 β-氧化作用，防止了合成的 ω6-PUFAs 的降解。

该课题组研究人员证明，在营养限制下，细胞为维持代谢会通过 β-氧化过程分解已合成的 ARA 和其他脂肪酸。因此，为了避免 β-氧化，他们去除了 PER 生物生成因子 Pex10，证明了 PEX10 的缺失是提高 ARA 等脂肪酸产量的有效工程靶点。

最后，通过加强脂肪酸合成的延伸单元——丙二酰辅酶 A（malonyl-CoA）的可用性提高了 ARA 的产量。

接下来，利用类似策略，研究人员也探索了定制生产GLA 和 DGLA的高产菌株。

总的来说，这项研究探索了在解脂耶氏酵母中定制生产 ω6-PUFA 的最佳生物合成途径。Δ6 途径适合 GLA 的合成，而 Δ8 途径适合 DGLA 和 ARA 的合成。通过加强为脂肪酸生物合成提供前体并缓解限制 PUFA 合成的底物二分法和底物竞争瓶颈，ω6-PUFA 的合成得到显著改善。

最终，各定制菌株合成的 GLA、DGLA 和 ARA 比例分别达到总脂肪酸含量的 22.58%、46.65% 和 11.30%，相应的摇瓶发酵滴度分别为 386.59、832.00 和 191.76 mg/L。

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