贺晓静团队揭示动粒在维持基因组稳定遗传和着丝粒稳态中的作用

真核细胞有丝分裂过程中，遗传物质的平均分配对于基因组稳定性以及子代细胞存活至关重要。CENP-A作为组蛋白H3变体是着丝粒的表观遗传标记。多亚基的超大蛋白质复合物——动粒（Kinetochore）附着于染色体着丝粒两侧并结合纺锤体微管，在维持姐妹染色单体的正确分离中发挥重要作用。作为内层动粒的核心成员，CENP-H/I/K/M复合物中亚基缺失或异常定位均会造成动粒功能障碍，从而导致染色体错误分离、细胞周期停滞以及细胞死亡【1】。

华中科技大学生命科学与技术学院贺晓静教授团队于2019年率先解析了嗜热真菌C. thermophilum (ct) CENP-I N端及与T. terrestris (th) CENP-H/K亚基的三元复合物晶体结构(NAR, 2019)【2】，提出了CENPH/I/K核心复合物“三明治“ 组装模型，CENP-I处于中间位置并支撑复合物的完整组装。后续国内外研究团队基于人源或酵母动粒的冷冻电镜结构均支持了以上观点【3-5】。虽然已经明确了CENP-H/I/K 复合物的三维结构以及动粒组装的核心位置，但该复合物在动粒中的功能，尤其是对CENP-A的调控缺乏理解。

2023年3月8日，贺晓静课题组在PNAS杂志（Direct Submission）上在线发表了题为CENP-I directly targets centromeric DNA to support CENP-A deposition and centromere maintenance的研究论文，揭示了动粒核心亚基CENP-I识别着丝粒DNA进而维持新合成CENP-A初始定位的分子机制与重要功能。

在本研究中，通过体外重组真菌和人源CENP-H/I/K/M复合物亚基，检测它们与各自种属着丝粒DNA的互作，发现仅CENP-I亚基可以通过N端HEAT Repeats结构域与不同种属的着丝粒DNA表现出保守性相互作用，暗示着CENP-I不仅仅是一个动粒中的支架蛋白，而是新的DNA结合蛋白。进一步研究表明CENP-I对DNA片段的AT碱基具有偏好性。此外，通过结合DNA，CENP-I与CENP-A核小体以及H3核小体均可发生互作，却产生截然相反的生物学功能。CENP-I与CENP-A核小体的结合能够稳定其结构以抵抗核酸酶的消化，而CENP-I与H3核小体的互作则会使H3核小体变得松散，暗示着CENP-I可能与着丝粒区域核小体的动态置换密切相关。

为了进一步探究CENP-I与DNA结合的关键氨基酸位点，通过同源序列比对和大量突变筛选，确定了CENP-I N端5个保守的碱性氨基酸位点在结合DNA中至关重要。进一步的生物物理与生物化学实验表明DNA结合位点突变体(CENP-I 3M/5M)破坏了CENP-I与着丝粒DNA的结合，并不影响CENP-I的正确折叠与活性，但对于CENP-I着丝粒定位以及动粒的组装十分重要。研究团队与合作者利用CRISPR-Cas9技术构建了内源CENP-I的条件性敲除HeLa细胞系，在诱导内源CENP-I降解的基础上表达CENP-I-WT/3M/5M，观察到CENP-I与DNA的互作能力缺失导致CENP-I的着丝粒定位在分裂间期和分裂中期均表现不同程度的减弱，同时染色体在分裂中期出现严重的队列异常。为了进一步检测CENP-A在着丝粒上的定位是否受到影响，研究团队在分裂间期引入CENP-I-WT/3M/5M，结合SNAP-tag探针标记检测了新合成CENP-A的着丝粒定位情况，结果表明CENP-I与DNA的互作能力缺失会显著降低新合成CENP-A的着丝粒装载效率，引起动粒组装异常，进一步证实了CENP-I作为动粒组分中新的DNA结合蛋白在着丝粒维持与动粒组装中发挥了重要作用。

文章修订过程中，人源动粒复合物及其与CENP-A核小体的电镜结构陆续发表【3,5,6】，从结构生物学角度证实了CENP-I与着丝粒的直接相互作用。结合国际上的最新研究进展，本研究丰富了CENP-H/I/K/M复合物结合并稳定着丝粒CENP-A核小体的分子模型：在酵母等单点着丝粒中，CENP-I通过与包裹CENP-A核小体的DNA互作与CENP-A核小体建立了直接联系；而在哺乳动物等区域着丝粒中，CENP-I则与核小体间的连接DNA结合，进而使CENP-H/I/K/M复合物与CENP-A核小体建立直接联系。本研究将CENP-I鉴定为动粒组分中一个新的着丝粒DNA结合亚基，提示了动粒在维持基因组稳定遗传和着丝粒稳态中发挥着重要作用。

华中科技大学生命科学与技术学院出站博士后胡立桥（现已入职广州实验室），博士生赵聪聪和刘明洁为文章的共同第一作者，贺晓静教授为文章通讯作者。生物物理所李国红研究员，中国科学与技术大学姚雪彪教授以及美国Tulane university刘洪教授为本研究提供重要支持和宝贵建议。

https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2219170120

参考文献：

1. K. L. McKinley, I. M. Cheeseman, The molecular basis for centromere identity and function. Nat Rev Mol Cell Biol17, 16–29 (2016).

2. L. Hu, et al., Structural analysis of fungal CENP-H/I/K homologs reveals a conserved assembly mechanism underlying proper chromosome alignment. Nucleic Acids Res47, 468–479 (2019).

3. T. Tian, et al., Structural insights into human CCAN complex assembled onto DNA. Cell Discov8, 90 (2022).

4. K. Yan, et al., Structure of the inner kinetochore CCAN complex assembled onto a centromeric nucleosome. Nature574, 278–282 (2019).

5. S. Yatskevich, et al., Structure of the human inner kinetochore bound to a centromeric CENP-A nucleosome. Science376, 844–852 (2022).

6. M. E. Pesenti, et al., Structure of the human inner kinetochore CCAN complex and its significance for human centromere organization. Mol Cell82, 2113-2131.e8 (2022).